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質(zhì)粒酶切條帶問題 已有2人參與
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質(zhì)粒構(gòu)建好之后沒有做酶切鑒定，直接送去測序了，測序是正確的�？涩F(xiàn)在做雙酶切時總是有些問題。如圖： 1 marker 2 質(zhì)粒 3BamH1單酶切 4Xhol單酶切 5 雙酶切 BamH1酶切時大片段下面出現(xiàn)了兩條帶 xhol酶切時大片段上面還有一條條帶，是沒有切開的嗎？ 雙酶切時也出現(xiàn)了大片段下面的兩條帶。不知道這個是什么。 還有因為目的片段才200bp，所以前幾次做酶切時總是看不到，是因為太小了嗎？ 謝謝 2014-07-27酶切.jpg |
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4樓2014-07-28 09:37:27
gyesang
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【答案】應助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-28 08:42:23
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coffee159: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-07-28 09:30:50
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DNA染色的亮度跟片段大小和分子數(shù)直接相關(guān)，由于你的片段很小，結(jié)合的燃料也很少，所以看上去不亮，從雙酶切的結(jié)果來看，是可以看到一個小條帶的，想看到更深的條帶，可以加大酶切質(zhì)粒的量 BamHI那個可能是非特異條帶，說不清楚 XhoI上面一個，你的質(zhì)粒那條泳道也有，可能是沒有切開的開環(huán)質(zhì)粒，總的來說，質(zhì)粒的質(zhì)量很好，沒有問題 |
2樓2014-07-27 22:09:04
luwei13566
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【答案】應助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-28 08:42:27
coffee159: 金幣+4, ★★★很有幫助, 謝謝，因為當時是用重疊PCR的方法，通過pcr載體把目的基因插入的，所以沒辦法pcr驗證。還有，最近提的質(zhì)粒，大小8000bp,酶切后總是在15000作用有一條帶，我不清楚這個是什么原因。質(zhì)粒不純的話測序能測出來嗎？ 2014-07-28 09:36:07
感謝參與，應助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-28 08:42:27
coffee159: 金幣+4, ★★★很有幫助, 謝謝，因為當時是用重疊PCR的方法，通過pcr載體把目的基因插入的，所以沒辦法pcr驗證。還有，最近提的質(zhì)粒，大小8000bp,酶切后總是在15000作用有一條帶，我不清楚這個是什么原因。質(zhì)粒不純的話測序能測出來嗎？ 2014-07-28 09:36:07
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1.BamHI酶切應該是出現(xiàn)star活性了。你的基因才200bp，下面兩條帶肯定是切到載體上了，還有略微彌散，我記得這個酶穩(wěn)定性不好。最好不要長時間切。 2.XhoI上面那個帶和你的質(zhì)粒對照應該是開環(huán)質(zhì)粒無誤。延長切割時間就消失掉了。 3.雙酶切下面那兩條帶還是BamHI的star活性，至于你下面那個不亮很正常，因為首先你的基因不一定完全釋放，可能一部分基因只是一端被切開，另一端還在載體上，就算你完全雙酶切后基因和載體的摩爾比是1比1，但是你的載體遠大于你的基因，嵌入的EB也遠比你基因多。 4.酶切效果不好可以換PCR驗證。 |
3樓2014-07-27 23:14:27
luwei13566
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5樓2014-07-28 15:03:20
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