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foodwl銀蟲 (初入文壇)
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[交流]
關(guān)于定量PCR做基因表達(dá)量的疑問(wèn) 已有2人參與
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作為剛開始接觸分子生物學(xué)的小白來(lái)說(shuō)，實(shí)在是有太多的不懂，所用言語(yǔ)存在的不適當(dāng)之處，還請(qǐng)大家多多批評(píng)指正。 表示一直對(duì)定量PCR的原理都看的不是太明白，不知道該怎么定一個(gè)相同的初始量來(lái)比較最終實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)想要的是樣品在不同貯藏時(shí)間中，某些基因得到表達(dá)量的變化。請(qǐng)教他人得來(lái)的最初方法是在提取總RNA之后，稀釋全部樣品的RNA濃度到統(tǒng)一的值，然后做反轉(zhuǎn)錄之后再將得到的所有樣品的cDNA的濃度調(diào)整到一致，然后做半定量PCR之后得到合適的引物，就可以做定量PCR了 今天又聽說(shuō)，在半定量PCR的時(shí)候還要調(diào)整全部樣品cDNA的量，使得所有樣品在P內(nèi)參基因后電泳的條帶亮度一致，然后再用這個(gè)的量來(lái)進(jìn)行定量PCR，這樣再調(diào)整的話，豈不是之前的量就不一致了么？？？ 因?yàn)楸臼切“�，是在是越�?lái)越暈，是有步驟重復(fù)了，還是怎樣，到底該如何保證定量PCR之前樣品量的一致性問(wèn)題呢？ 實(shí)時(shí)定量的時(shí)候還是每個(gè)樣品都要做一個(gè)內(nèi)參么？ 求各位大俠相助，不勝感激  |
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vapordw
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半定量是這樣操作的，反轉(zhuǎn)錄相同的RNA用量（如1ugRNA），用actin引物去擴(kuò)增每個(gè)樣本，雖然反轉(zhuǎn)錄用的是相同的RNA量，但是actin擴(kuò)增出來(lái)的片段還是會(huì)有亮度差異的問(wèn)題，這時(shí)就得根據(jù)不同的亮度調(diào)整每個(gè)模板的用量，待actin擴(kuò)增的片段亮度調(diào)成大體一致后，每個(gè)模板的用量也會(huì)不盡相同，然后用基因的引物在每個(gè)模板里擴(kuò)增，每個(gè)模板的用量和調(diào)好actin的模板用量一致，這樣就會(huì)得到基因的表達(dá)量的差異。 定量PCR可以不調(diào)模板濃度，因?yàn)槊總�(gè)模板都要做內(nèi)參，通過(guò)計(jì)算每個(gè)模板的內(nèi)參來(lái)計(jì)算每個(gè)模板基因的表達(dá)量。 |
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foodwl
2樓2014-08-17 18:55:42
foodwl
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4樓2014-09-09 10:53:12
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