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foodwl銀蟲 (初入文壇)
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[交流]
關(guān)于定量PCR做基因表達量的疑問 已有2人參與
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作為剛開始接觸分子生物學(xué)的小白來說，實在是有太多的不懂，所用言語存在的不適當(dāng)之處，還請大家多多批評指正。 表示一直對定量PCR的原理都看的不是太明白，不知道該怎么定一個相同的初始量來比較最終實時定量PCR的結(jié)果。 實驗想要的是樣品在不同貯藏時間中，某些基因得到表達量的變化。請教他人得來的最初方法是在提取總RNA之后，稀釋全部樣品的RNA濃度到統(tǒng)一的值，然后做反轉(zhuǎn)錄之后再將得到的所有樣品的cDNA的濃度調(diào)整到一致，然后做半定量PCR之后得到合適的引物，就可以做定量PCR了 今天又聽說，在半定量PCR的時候還要調(diào)整全部樣品cDNA的量，使得所有樣品在P內(nèi)參基因后電泳的條帶亮度一致，然后再用這個的量來進行定量PCR，這樣再調(diào)整的話，豈不是之前的量就不一致了么？？？ 因為本是小白，是在是越來越暈，是有步驟重復(fù)了，還是怎樣，到底該如何保證定量PCR之前樣品量的一致性問題呢？ 實時定量的時候還是每個樣品都要做一個內(nèi)參么？ 求各位大俠相助，不勝感激  |
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foodwl
銀蟲 (初入文壇)
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-08-17 20:33:07
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-08-17 20:33:07
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半定量是這樣操作的，反轉(zhuǎn)錄相同的RNA用量（如1ugRNA），用actin引物去擴增每個樣本，雖然反轉(zhuǎn)錄用的是相同的RNA量，但是actin擴增出來的片段還是會有亮度差異的問題，這時就得根據(jù)不同的亮度調(diào)整每個模板的用量，待actin擴增的片段亮度調(diào)成大體一致后，每個模板的用量也會不盡相同，然后用基因的引物在每個模板里擴增，每個模板的用量和調(diào)好actin的模板用量一致，這樣就會得到基因的表達量的差異。 定量PCR可以不調(diào)模板濃度，因為每個模板都要做內(nèi)參，通過計算每個模板的內(nèi)參來計算每個模板基因的表達量。 |
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2樓2014-08-17 18:55:42
3樓2014-08-18 09:53:26
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