zans2009

銅蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 459
帖子: 44
在線: 14.9小時
蟲號: 1427526
注冊: 2011-10-04
性別: GG
專業(yè): 生物信息學

[求助] 用鑒定真菌的通用引物its1、its4，為何擴出目的條帶呢已有3人參與

剛篩選出4種真菌，用通用引物做pcr，從電泳圖上看，請問我出了哪些問題呢？
1號出現(xiàn)彌散條帶，2號條帶范圍從400bp到550bp間，3、4號出現(xiàn)了不止一個條帶，而且最大的達到5000bp，我弄錯了什么嗎？沒分離完全？還是PCR出了問題？

反應(yīng)溫度如下：
94℃    3min

94℃    30s
55℃    45s
72℃    1min
35cycle

72℃    3min

通用引物
ITSl(5’一TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3’)
ITS4(5’一TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC一3’)

四種DNA濃度分別為15ng/ul、31ng/ul、 168ng/ul、 27ng/ul、
260/280分別為1.77、1.63、1.82、1.74。

謝謝了

2014-8-26 _副本.jpg

回復(fù)此樓

» 猜你喜歡

不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線已經(jīng)有0人回復(fù)
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費? 已經(jīng)有99人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千” 已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù)
納米粒度分析已經(jīng)有3人回復(fù)
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京已經(jīng)有0人回復(fù)
留學--博士招生已經(jīng)有16人回復(fù)
化學工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限已經(jīng)有4人回復(fù)
邵陽學院食品與化學工程學院碩士調(diào)劑已經(jīng)有0人回復(fù)

» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:

真菌多樣性研究中引物選擇問題~~~ 已經(jīng)有14人回復(fù)
真菌ITS鑒定所使用的同用引物叫ITS1-4,還有ITS1f-4 已經(jīng)有4人回復(fù)
同一菌種用細菌和真菌引物都跑出了條帶，誰能給解釋一下？已經(jīng)有10人回復(fù)
關(guān)于真菌18S在NCBI上BLAST問題已經(jīng)有8人回復(fù)
ITS1/4序列進行blast同源比對問題已經(jīng)有4人回復(fù)
轉(zhuǎn)化后細菌提質(zhì)粒，PCR條帶很詭異已經(jīng)有14人回復(fù)
怎樣從土壤中得到總的真菌？已經(jīng)有11人回復(fù)
PCR擴增出來的條帶,與預(yù)計大小一致,測序居然什么都不是???? 已經(jīng)有4人回復(fù)
真菌ITS鑒定問題若干已經(jīng)有8人回復(fù)
小鼠基因型PCR鑒定被污染，怎么破？已經(jīng)有5人回復(fù)
真菌轉(zhuǎn)化子PCR驗證問題已經(jīng)有20人回復(fù)
真菌18S，28S，ITS區(qū)段。已經(jīng)有14人回復(fù)
T-RFLP技術(shù)中，真菌的PCR問題已經(jīng)有11人回復(fù)
急急急！巢式PCR，第二輪產(chǎn)物跑膠點樣孔有亮帶，似有東西跑不出已經(jīng)有7人回復(fù)
絲狀真菌ITS引物及PCR條件？已經(jīng)有10人回復(fù)
ITS1和ITS4做樣品體系中真菌菌株鑒定，為啥PCR產(chǎn)物竟然是2個條帶？已經(jīng)有11人回復(fù)
5 RACE inner-PCR電泳結(jié)果無條帶，是怎么回事？已經(jīng)有4人回復(fù)
用PCR擴增后的DNA如何測序？不能直接用PCR就知道是什么菌種之類的吧？已經(jīng)有6人回復(fù)
我在跑膠時的DNA片段大小為什么與測序后的相差很大呢？？？求大俠指導！已經(jīng)有13人回復(fù)
求助關(guān)于土壤細菌分離鑒定的知識，希望朋友幫忙解答已經(jīng)有8人回復(fù)
土壤真菌PCR-DGGE中真菌ITS區(qū)引物的選擇已經(jīng)有10人回復(fù)
請問大家做PCR-DGGE的時候真菌細菌放線菌分別用什么引物？ O(∩_∩)O謝謝已經(jīng)有13人回復(fù)
向NCBI提交序列問題已經(jīng)有8人回復(fù)
真菌ITS序列PCR擴增求助已經(jīng)有9人回復(fù)
PCR的BUFFER和DNTPS可以在室溫放嗎？能放多久？謝謝已經(jīng)有11人回復(fù)
【求助/交流】關(guān)于ITS引物的選擇已經(jīng)有5人回復(fù)

1樓 2014-08-27 10:12:50

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zans2009

銅蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 459
帖子: 44
在線: 14.9小時
蟲號: 1427526
注冊: 2011-10-04
性別: GG
專業(yè): 生物信息學

對了，25ul體系，PCR時引物加1ul、DNA加3ul。

贊一下

回復(fù)此樓

2樓2014-08-27 10:19:16

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

huyan0817

木蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 55 (初中生)
金幣: 3604.8
紅花: 3
帖子: 344
在線: 119.7小時
蟲號: 1232425
注冊: 2011-03-14
性別: GG
專業(yè): 生物物理、生物化學與分子

【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zans2009(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-08-27 19:14:35

引用回帖:

2樓: Originally posted by zans2009 at 2014-08-27 10:19:16
對了，25ul體系，PCR時引物加1ul、DNA加3ul。

DNA模板太多了,可以稀釋20-50倍加1ul！另外不知道樓主的目的是什么，只從電泳圖看，1號2號P的挺好，不存在彌散條帶，膠回收下就好了，沒問題。3號4號條帶多說明你的引物出現(xiàn)了非特異性擴增，畢竟你用的通用引物這個很正常，只要有你想要的目的片斷就可以了，膠回收就可以了！

贊一下

回復(fù)此樓

3樓2014-08-27 11:03:15

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zans2009

銅蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 459
帖子: 44
在線: 14.9小時
蟲號: 1427526
注冊: 2011-10-04
性別: GG
專業(yè): 生物信息學

引用回帖:

3樓: Originally posted by huyan0817 at 2014-08-27 11:03:15
DNA模板太多了,可以稀釋20-50倍加1ul！另外不知道樓主的目的是什么，只從電泳圖看，1號2號P的挺好，不存在彌散條帶，膠回收下就好了，沒問題。3號4號條帶多說明你的引物出現(xiàn)了非特異性擴增，畢竟你用的通用引物這個 ...

我篩出4種真菌，做PCR是打算膠回收后測序做鑒定的，用its通用引物P出真菌的its2序列應(yīng)該是500bp左右吧�，F(xiàn)在3、4號出現(xiàn)5kb的條帶，而且500bp處的條帶不如1、2號那么明顯，心里沒譜了

贊一下

回復(fù)此樓

4樓2014-08-27 11:46:22

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

huyan0817

木蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 55 (初中生)
金幣: 3604.8
紅花: 3
帖子: 344
在線: 119.7小時
蟲號: 1232425
注冊: 2011-03-14
性別: GG
專業(yè): 生物物理、生物化學與分子

【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

4樓: Originally posted by zans2009 at 2014-08-27 11:46:22
我篩出4種真菌，做PCR是打算膠回收后測序做鑒定的，用its通用引物P出真菌的its2序列應(yīng)該是500bp左右吧。現(xiàn)在3、4號出現(xiàn)5kb的條帶，而且500bp處的條帶不如1、2號那么明顯，心里沒譜了...

樓主可以嘗試把退火溫度再降幾度,模板稀釋20-50倍,再做PCR!

贊一下

回復(fù)此樓

5樓2014-08-27 12:59:38

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zans2009

銅蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 459
帖子: 44
在線: 14.9小時
蟲號: 1427526
注冊: 2011-10-04
性別: GG
專業(yè): 生物信息學

引用回帖:

5樓: Originally posted by huyan0817 at 2014-08-27 12:59:38
樓主可以嘗試把退火溫度再降幾度,模板稀釋20-50倍,再做PCR!...

好的，我明天試試看。

贊一下

回復(fù)此樓

6樓2014-08-27 16:39:50

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

yuren2009

木蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 113 (高中生)
金幣: 5670.8
散金: 96
紅花: 3
帖子: 806
在線: 294.9小時
蟲號: 2008028
注冊: 2012-09-17
性別: GG
專業(yè): 植物病理學

【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zans2009(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2014-08-27 19:14:46

DNA加1即可，通用引物ITS1和ITS4用于大多數(shù)擔子菌和子囊菌�；蚪M這么大，即便是通用引物不一定特異性很高，都能擴增出來。重新PCR還是如此的話，可以換一下引物。

贊一下

回復(fù)此樓

學習使你立于不敗之地

7樓2014-08-27 17:14:36

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

angelyou

鐵蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 28 (小學生)
金幣: 292
帖子: 171
在線: 65.1小時
蟲號: 1625043
注冊: 2012-02-18
專業(yè): 植物病理學

【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zans2009(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2014-08-27 19:14:59

1號2號應(yīng)該沒啥問題，一般ITS都是500多600多的大小，后面那兩個估計是因為種的原因有非特異性的結(jié)合，可以切五六百的帶回收，或者根據(jù)真菌種類考慮用別的方法鑒定

贊一下

回復(fù)此樓

8樓2014-08-27 18:36:53

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zans2009

銅蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 459
帖子: 44
在線: 14.9小時
蟲號: 1427526
注冊: 2011-10-04
性別: GG
專業(yè): 生物信息學

引用回帖:

7樓: Originally posted by yuren2009 at 2014-08-27 17:14:36
DNA加1即可，通用引物ITS1和ITS4用于大多數(shù)擔子菌和子囊菌�；蚪M這么大，即便是通用引物不一定特異性很高，都能擴增出來。重新PCR還是如此的話，可以換一下引物。

因為只知道是某種真菌，但不知道是哪種真菌，如果更換引物的話，前輩建議用哪種引物呢？

贊一下

回復(fù)此樓

9樓2014-08-27 19:32:01

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zans2009

銅蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 1 (幼兒園)
金幣: 459
帖子: 44
在線: 14.9小時
蟲號: 1427526
注冊: 2011-10-04
性別: GG
專業(yè): 生物信息學

引用回帖:

8樓: Originally posted by angelyou at 2014-08-27 18:36:53
1號2號應(yīng)該沒啥問題，一般ITS都是500多600多的大小，后面那兩個估計是因為種的原因有非特異性的結(jié)合，可以切五六百的帶回收，或者根據(jù)真菌種類考慮用別的方法鑒定

因為是第一次做這方面的工作，有些還不是很明白。
電泳出現(xiàn)無單一的條帶，不知道是否是因為沒有純化好。
在真菌鑒定中，用ITS做PCR出現(xiàn)5kb的非特異條帶的情況普遍嗎？貌似文獻中沒有提及非特異條帶的問題。

贊一下

回復(fù)此樓

10樓2014-08-27 19:39:31

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]	作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 材料科學與工程求調(diào)劑 +3	深V宿舍吧 2026-03-29	3/150	2026-03-29 17:24 by ACS Nano——
[考研] 材料專碩調(diào)劑 +3	椰椰。 2026-03-29	3/150	2026-03-29 16:53 by 學員8dgXkO
[考研] 求調(diào)劑 +4	青春裁為三截 2026-03-29	4/200	2026-03-29 15:01 by 唐沐兒
[基金申請] 面上5B能上會嗎？ +3	redcom 2026-03-29	3/150	2026-03-29 12:03 by god_tian
[考研] 317分一志愿南理工材料工程本科湖工大求調(diào)劑 +9	芋泥小鈴鐺 2026-03-28	9/450	2026-03-29 11:46 by longlotian
[碩博家園] 求調(diào)劑有機化學考研356分 +3	Nadiums 2026-03-25	4/200	2026-03-29 00:50 by 544594351
[考研] 一志愿中南大學化學0703總分337求調(diào)劑 +5	niko- 2026-03-27	5/250	2026-03-28 14:25 by 唐沐兒
[考研] 299求調(diào)劑 +7	嗯嗯嗯嗯2 2026-03-27	7/350	2026-03-28 13:09 by 唐沐兒
[考研] 266分，求材料冶金能源化工等調(diào)劑 +7	哇呼哼呼哼 2026-03-27	9/450	2026-03-28 12:22 by zllcz
[考研] 07化學280分求調(diào)劑 +10	722865 2026-03-23	10/500	2026-03-27 15:51 by Plutoqq
[考研] 279 分求調(diào)劑 +4	睡個好覺_16 2026-03-24	4/200	2026-03-27 15:05 by 醉在風里
[考研] 312求調(diào)劑 +9	上岸吧ZJY 2026-03-22	13/650	2026-03-27 11:24 by sanrepian
[考研] 考研調(diào)劑 +9	小蠟新筆 2026-03-26	9/450	2026-03-27 11:10 by 不吃魚的貓
[考研] 292求調(diào)劑 +4	求求了收下我吧?/a> 2026-03-26	4/200	2026-03-27 10:37 by zhshch
[考研] 324求調(diào)劑 +5	hanamiko 2026-03-26	5/250	2026-03-27 10:33 by wangjy2002
[考研] 081200-11408-276學碩求調(diào)劑 +3	崔wj 2026-03-26	3/150	2026-03-26 19:57 by nihaoar
[考研] 一志愿哈工大，085400，320，求調(diào)劑 +4	gdlf9999 2026-03-24	4/200	2026-03-25 23:01 by boxking200
[考研] 332求調(diào)劑 +6	032500 2026-03-25	6/300	2026-03-25 22:45 by 418490947
[考研] 334分一志愿武理-080500 材料求調(diào)劑 +4	李李不服輸 2026-03-25	4/200	2026-03-25 21:26 by 星空星月
[考研] 一志愿吉大化學322求調(diào)劑 +4	17501029541 2026-03-23	6/300	2026-03-24 10:21 by 戴圍脖的小蚊子