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clark2010金蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
雙酶切經(jīng)驗(yàn)分享 已有1人參與
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前段時(shí)間做了雙酶切后連接，載體7.5 Kb （小片段只有300 bp）， 連接用片段是從T載體上切下來(lái)的，分別是1 Kb，1.5 Kb，和2 Kb，fermentas的fast酶，切了15min后膠回收，連接轉(zhuǎn)化之后挑單菌驗(yàn)證，各挑兩個(gè)轉(zhuǎn)化子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有1 Kb的片段連上了，其余4個(gè)都是載體自連。 第二次做的時(shí)候兩個(gè)酶的用量都減半，然后將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到1 h，最后挑了6個(gè)轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證全部正確。 個(gè)人認(rèn)為可能的原因： 在說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)了酶的用量加起來(lái)不能超過(guò)總體積的1/10，而兩個(gè)都按20 uL體系加1 uL酶的話(huà)，如果槍尖沾點(diǎn)甘油，打進(jìn)去就超過(guò)1/10了，可能會(huì)影響某些酶的效率，酶的用量減半可以解決這個(gè)問(wèn)題。而延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可以彌補(bǔ)酶量不足的問(wèn)題，所以可以得到比較好的結(jié)果。 個(gè)人意見(jiàn)，請(qǐng)大家討論。 |
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潘潘0227
銅蟲(chóng) (小有名氣)
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- 專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
2樓2015-10-31 20:20:05
clark2010
金蟲(chóng) (小有名氣)
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個(gè)人覺(jué)得，首先可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。 或者，即使酶切不完全，單酶切和雙酶切的片段跑膠總是能分開(kāi)的吧，加大酶切反應(yīng)體系，切膠回收的時(shí)候回收雙酶切那個(gè)片段就行，回收完之后洗脫的水別加太多，DNA濃度會(huì)高一些。 如果分不開(kāi)，酶切的同時(shí)將載體去磷酸化，可以防止自連，這樣，連接你的目的片段之后，篩選到楊興克隆的幾率也大一些。 最后，注意一下，測(cè)一下DNA濃度，酶切的時(shí)候DNA別加太多了，太多了會(huì)切不完全的。具體用量，請(qǐng)參考你所用的內(nèi)切酶的說(shuō)明書(shū)。 暫時(shí)能想到的就這么多了。 |
3樓2015-11-01 04:51:36
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