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張永婧1991新蟲 (初入文壇)
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[求助]
T-RFLP中回收及酶切相關(guān)問題 已有4人參與
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我做的是腸道微生物多態(tài)性，用T-RFLP技術(shù)，已經(jīng)提取出基因組總DNA，PCR體系為25ul,用通用引物擴增出目的片段，1500bp左右，條帶較亮且單一，無引物二聚體等其他雜物，然后用2%的瓊脂糖凝膠跑電泳做切膠回收，用的是Axygen的凝膠回收試劑盒，每次每孔回收上樣量為10ul，然后將3個孔的條帶切膠回收，回收后的DNA濃度卻只有10ng/ul左右，用過天根的試劑盒也是基本上差不多。然后看到論壇上有人說單一條帶可以不同切膠回收直接就酶切就可以，于是按照酶切體系進行酶切，PCR產(chǎn)物用5ul,酶用1ul。結(jié)果還是沒有條帶，正常情況如果不酶切的話，那條目的條帶應(yīng)該是存在的吧，但是酶切之后沒有，說明是切開了？可是什么小條帶都看不見。。還有就是如果直接PCR產(chǎn)物酶切的話，這個產(chǎn)物還要做什么預(yù)處理嗎？求求各位大神，這些都快做了一個月了，還是沒有結(jié)果。。。快哭了呀！以前沒接觸過分子，望大神指導(dǎo)！圖1是回收后做酶切的條帶，就是這種情況。 圖1.jpg |
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