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[求助]
新手求問(wèn)Western Blot中裂解細(xì)胞、抗體選擇、轉(zhuǎn)膜、磷酸化蛋白檢測(cè)等問(wèn)題 已有2人參與
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要畢業(yè)啦，可是還有一部分實(shí)驗(yàn)需要用Western Blot，才剛開始學(xué)，那個(gè)急啊！上手遇到各種問(wèn)題。 其一，在裂解細(xì)胞收集蛋白時(shí)，我用的是碧云天的RIPA裂解液，先加了PMSF和蛋白酶抑制劑分裝與-20保存的，臨用前解凍加入磷酸酶抑制劑，但我看網(wǎng)上寫的PMSF是需要臨用現(xiàn)加的，就不知道我的方法會(huì)不會(huì)有問(wèn)題。想問(wèn)問(wèn)是不是應(yīng)該先將蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑加入裂解液中分裝保存，臨用時(shí)再加PMSF呢？ 其二，我用的是碧云天的抗體，不知道該公司的抗體如何�。课沂且獧z測(cè)磷酸化蛋白如P38、ERK、JNK等，聽說(shuō)磷酸化蛋白不是很好做，這幾個(gè)呢？如果國(guó)產(chǎn)抗體不好，哪些公司的抗體會(huì)好一些？磷酸化蛋白檢測(cè)需要注意些什么問(wèn)題？ 其三，就是我實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題了……我同時(shí)做了兩塊膠，在轉(zhuǎn)膜時(shí)同一個(gè)三明治里面放的，即兩張海綿/兩張濾紙/膠/膜/兩張濾紙/一張海綿/兩張濾紙/膠/膜/兩張濾紙/兩張海綿，300mA, 2h，很神奇的是靠近負(fù)極的那張膠全轉(zhuǎn)到膜上了，靠近正極的卻只轉(zhuǎn)了一部分，這是什么原因�。� 此外，我還遇到一個(gè)問(wèn)題，用ECL顯色5min后放入bio-rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影，發(fā)現(xiàn)顯色過(guò)久的話那個(gè)試劑基本上就嵌入膜里了，根本無(wú)法用一抗二抗去除液洗掉，這個(gè)時(shí)候該怎么辦呢？如果strip液洗太久會(huì)不會(huì)把蛋白也給洗下來(lái)了？ 好糾結(jié)啊，沒(méi)有多少時(shí)間可以慢慢做實(shí)驗(yàn)了，還請(qǐng)各位高手指教��！ |
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上張圖吧，磚模反了，估計(jì)是黑膠白膜沒(méi)放對(duì)，或者電極放錯(cuò)了，多問(wèn)實(shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃惆。叶际桥R時(shí)加PMSF，你是AP,,還是HRP顯色，看到目的條帶，水沖就可以終止顯色啊，多和實(shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃憬涣靼? 
2樓2014-11-05 19:03:10
日子妞兒
新蟲 (初入文壇)
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3樓2014-11-14 14:07:19
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