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新手求問Western Blot中裂解細(xì)胞、抗體選擇、轉(zhuǎn)膜、磷酸化蛋白檢測等問題 已有2人參與
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要畢業(yè)啦，可是還有一部分實驗需要用Western Blot，才剛開始學(xué)，那個急啊！上手遇到各種問題。 其一，在裂解細(xì)胞收集蛋白時，我用的是碧云天的RIPA裂解液，先加了PMSF和蛋白酶抑制劑分裝與-20保存的，臨用前解凍加入磷酸酶抑制劑，但我看網(wǎng)上寫的PMSF是需要臨用現(xiàn)加的，就不知道我的方法會不會有問題。想問問是不是應(yīng)該先將蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑加入裂解液中分裝保存，臨用時再加PMSF呢？ 其二，我用的是碧云天的抗體，不知道該公司的抗體如何��？我是要檢測磷酸化蛋白如P38、ERK、JNK等，聽說磷酸化蛋白不是很好做，這幾個呢？如果國產(chǎn)抗體不好，哪些公司的抗體會好一些？磷酸化蛋白檢測需要注意些什么問題？ 其三，就是我實驗中遇到的問題了……我同時做了兩塊膠，在轉(zhuǎn)膜時同一個三明治里面放的，即兩張海綿/兩張濾紙/膠/膜/兩張濾紙/一張海綿/兩張濾紙/膠/膜/兩張濾紙/兩張海綿，300mA, 2h，很神奇的是靠近負(fù)極的那張膠全轉(zhuǎn)到膜上了，靠近正極的卻只轉(zhuǎn)了一部分，這是什么原因��？ 此外，我還遇到一個問題，用ECL顯色5min后放入bio-rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影，發(fā)現(xiàn)顯色過久的話那個試劑基本上就嵌入膜里了，根本無法用一抗二抗去除液洗掉，這個時候該怎么辦呢？如果strip液洗太久會不會把蛋白也給洗下來了？ 好糾結(jié)啊，沒有多少時間可以慢慢做實驗了，還請各位高手指教��！ |
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日子妞兒
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 獸醫(yī)免疫學(xué)
3樓2014-11-14 14:07:19
上張圖吧，磚模反了，估計是黑膠白膜沒放對，或者電極放錯了，多問實驗室?guī)熜謳熃惆。叶际桥R時加PMSF，你是AP,,還是HRP顯色，看到目的條帶，水沖就可以終止顯色啊，多和實驗室?guī)熜謳熃憬涣靼? 2樓2014-11-05 19:03:10
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