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zcqh27木蟲 (正式寫手)
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[交流]
關(guān)于IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的幾個問題
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1，當(dāng)培養(yǎng)條件中有葡萄糖時，IPTG是否可以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)？會不會存在葡萄糖效應(yīng)？ 2，被IPTG誘導(dǎo)的菌體是否可以在繼續(xù)分裂繁殖，如果可以，那么繁殖的下一代是可以直接表達(dá)目的蛋白，還是需要額外的一分子IPTG誘導(dǎo)后才能表達(dá)。 3，IPTG結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)像發(fā)生改變，所以才能誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，那么IPTG使阻遏蛋白構(gòu)象變化后，是一直結(jié)合在阻遏蛋白上，還是脫落下來再去結(jié)合別的阻遏蛋白？ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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我的簡單理解，希望對樓主有幫助，不正之處請大家指教。 1.培養(yǎng)基中有葡萄糖，IPTG還是能誘導(dǎo)葡萄糖表達(dá)的，很多培養(yǎng)基里都含葡萄糖的。至于會不會有葡萄糖效應(yīng)，就比較復(fù)雜，細(xì)菌內(nèi)cAMP濃度應(yīng)該受多種因素影響，即使有葡萄糖效應(yīng)，也只是表達(dá)效率不夠高吧。 2.IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌高表達(dá)目標(biāo)蛋白，增殖會被抑制，但仍然可以增殖。增殖后的細(xì)菌當(dāng)然也需要IPTG分子進(jìn)入，結(jié)合阻遏蛋白，才能表達(dá)目標(biāo)蛋白。 3.阻遏蛋白和IPTG結(jié)合后，不能結(jié)合在啟動子區(qū)，目標(biāo)蛋白可以表達(dá)。如果IPTG脫落，阻遏蛋白就可以重新結(jié)合DNA,阻遏蛋白表達(dá)。原則上分子間相互作用是動態(tài)的，IPTG與阻遏蛋白的結(jié)合解離也應(yīng)該是動態(tài)的。雖然沒查過，IPTG應(yīng)該是結(jié)合阻遏蛋白容易，解離難吧，當(dāng)然如果該阻遏蛋白老化被降解，IPTG一定是被釋放，再結(jié)合其它阻遏蛋白。 |
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3樓2014-11-16 10:25:14
zcqh27
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1，也就是說，在誘導(dǎo)期間，菌體密度會一直增加，所以還需要一直補(bǔ)充IPTG，用于誘導(dǎo)那些新繁殖出來的菌體。 2，在搖瓶中，初始誘導(dǎo)菌體密度是0.6，加0.1mM的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束時，OD值在5左右。那也就是說，一開始加入的0.1的IPTG就是過量的，多余的IPTG用于誘導(dǎo)新增殖的菌體。 3，如果是在發(fā)酵罐里，通過補(bǔ)料菌體密度會更高，也就是需要加入更多的IPTG，需要更長的誘導(dǎo)時間了。 4，能詳細(xì)介紹一下葡萄糖對IPTG誘導(dǎo)的影響嗎。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
4樓2014-11-17 22:15:32
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對，應(yīng)該加足量的IPCG。有人會通過預(yù)實驗比較不同IPCG濃度的蛋白表達(dá)量，找到最適IPCG誘導(dǎo)濃度。 葡萄糖和IPCG誘導(dǎo)是兩個機(jī)制。對大腸桿菌來說，葡萄糖存在于培養(yǎng)基時，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度下降，沒葡萄糖存在，cAMP濃度高，CAP蛋白可結(jié)合高濃度cAMP后變構(gòu)，與lac操縱子調(diào)控序列結(jié)合，使lac的三個基因表達(dá)上調(diào)。 不過IPCG誘導(dǎo)的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過改造，你感興趣可以查一下載體序列，確定有沒有CAP-cAMP結(jié)合序列。或者你直接問公司的技術(shù)支持。 |
5樓2014-11-17 22:41:06
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6樓2014-11-17 22:45:17
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7樓2016-01-24 14:45:36
guoliwang
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8樓2016-01-25 00:31:18
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