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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » IPTG誘導表達的問題
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applexixixi木蟲 (小有名氣)
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[求助]
IPTG誘導表達的問題
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各位朋友，有誰做過大腸桿菌的IPTG誘導表達？我有一些問題想咨詢一下。 1，是不是一定要把大腸培養(yǎng)到對數期再加IPTG誘導？具體OD值是多少有明確要求嗎？ 2，我的表達質粒是pUC18加了我的目的基因，不同質粒對IPTG誘導表達有什么影響嗎？我看文獻用pET系列的很多，這個區(qū)別大嗎？ 3，要表達不同的目的基因，誘導的具體條件是不是不同呢？都需要做哪些條件的優(yōu)化？比如菌的OD值，IPTG濃度，誘導時間都需要做嗎？ 哪位朋友有現成的實驗方案最好了，希望能分享一下。 |
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【答案】應助回帖
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30個金幣啊，可真真是不少的財物，見錢心喜了。 根據我多年IPTG誘導表達，主要是搖瓶的誘導表達經驗(發(fā)酵罐我們不用IPTG了)來大致地闡述一下： (1)質粒復制，蛋白誘導表達都是一個耗能的過程，會消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代謝負荷，抑制了宿主菌本身的生長繁殖。 (2)IPTG誘導表達其實沒有嚴格OD600nm限定范圍，不過很多人喜歡在對數初期(OD600nm=0.3-0.6)進行誘導，因為這個時候菌活力最高，誘導表達增加的負荷完全承受的住，并且菌體這個時候不會產生大量的副代謝產物，因此有利于產物表達和菌體繁殖。 (3)個人喜歡在對數后期或者平穩(wěn)期(OD600nm=2-3)誘導表達。對數初期誘導表達菌量不高，IPTG濃度相對較高，增加的負荷較大，因此最終誘導完畢菌體量較低，大概2-3左右。對數后期誘導菌體量較高，IPTG濃度相對較低，減少了負荷，最終菌體量較高。最重要的是對數后期誘導有利于結構蛋白 折疊，形成正確的結構，原理可能是后期誘導菌體蛋白表達速率下降，菌體各種輔助蛋白折疊的產物較多，因而有利于獲得可溶性蛋白。 (4)最后一點，不管是那個時期誘導，必然能獲得你需要的蛋白。搖瓶體系中，大腸桿菌能完全承受IPTG誘導表達，無需多慮。 |
3樓2012-12-11 14:31:10
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大腸桿菌誘導表達分成兩個階段：培養(yǎng)和誘導 (1) 培養(yǎng) 接種，30℃培養(yǎng)，待OD600nm=2-3，或者1-2時進行誘導。接種量千分之五。培養(yǎng)時間7-8h或者5-6h。 (2)誘導 30℃誘導，即下班前或者17點左右誘導。誘導是overnight。37℃菌體生長最快，各種酶活性最好，因此誘導時間短。但是37℃絕大部分都是包涵體，除非你做包涵體復興。 (3)30℃培養(yǎng)是為了和誘導溫度一致，降溫太多對菌體活力有負面的影響，特別是溫度降低5℃以下時。再加上你誘導產生的代謝負荷，因此不建議培養(yǎng)和誘導表達溫度相差太大。 (4) 這些都是我們的經驗和理論總結。 |
8樓2012-12-18 17:09:16
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首先，IPTG濃度誘導一般可以在對數初期（OD,得需要你測生長曲線再定了）進行，這個時候菌體活性不錯，扛得住；但是對于一些特殊要求的實驗，比如表達的基因對于底物的利用很關鍵，那么需要一接種就誘導，要不然漲不起來的（但是這類一般就采用組成型，不用誘導型了）。 IPTG濃度，嚴格來說每種質粒（比如PUC18在MCS區(qū)插基因）都只需要探索一次即可（有的載體有的基因型最適表達量是不同滴）； 至于條件的摸索，一般先按文獻試試，只有不如人意時，才摸索看看有沒有改進，一般不是一上來就做這么多滴！ |
2樓2012-12-11 10:09:15
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