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applexixixi木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的問(wèn)題
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各位朋友，有誰(shuí)做過(guò)大腸桿菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)？我有一些問(wèn)題想咨詢(xún)一下。 1，是不是一定要把大腸培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期再加IPTG誘導(dǎo)？具體OD值是多少有明確要求嗎？ 2，我的表達(dá)質(zhì)粒是pUC18加了我的目的基因，不同質(zhì)粒對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)有什么影響嗎？我看文獻(xiàn)用pET系列的很多，這個(gè)區(qū)別大嗎？ 3，要表達(dá)不同的目的基因，誘導(dǎo)的具體條件是不是不同呢？都需要做哪些條件的優(yōu)化？比如菌的OD值，IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間都需要做嗎？ 哪位朋友有現(xiàn)成的實(shí)驗(yàn)方案最好了，希望能分享一下。 |
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30個(gè)金幣啊，可真真是不少的財(cái)物，見(jiàn)錢(qián)心喜了。 根據(jù)我多年IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，主要是搖瓶的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)驗(yàn)(發(fā)酵罐我們不用IPTG了)來(lái)大致地闡述一下： (1)質(zhì)粒復(fù)制，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)都是一個(gè)耗能的過(guò)程，會(huì)消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代謝負(fù)荷，抑制了宿主菌本身的生長(zhǎng)繁殖。 (2)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)其實(shí)沒(méi)有嚴(yán)格OD600nm限定范圍，不過(guò)很多人喜歡在對(duì)數(shù)初期(OD600nm=0.3-0.6)進(jìn)行誘導(dǎo)，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候菌活力最高，誘導(dǎo)表達(dá)增加的負(fù)荷完全承受的住，并且菌體這個(gè)時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生大量的副代謝產(chǎn)物，因此有利于產(chǎn)物表達(dá)和菌體繁殖。 (3)個(gè)人喜歡在對(duì)數(shù)后期或者平穩(wěn)期(OD600nm=2-3)誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)數(shù)初期誘導(dǎo)表達(dá)菌量不高，IPTG濃度相對(duì)較高，增加的負(fù)荷較大，因此最終誘導(dǎo)完畢菌體量較低，大概2-3左右。對(duì)數(shù)后期誘導(dǎo)菌體量較高，IPTG濃度相對(duì)較低，減少了負(fù)荷，最終菌體量較高。最重要的是對(duì)數(shù)后期誘導(dǎo)有利于結(jié)構(gòu)蛋白 折疊，形成正確的結(jié)構(gòu)，原理可能是后期誘導(dǎo)菌體蛋白表達(dá)速率下降，菌體各種輔助蛋白折疊的產(chǎn)物較多，因而有利于獲得可溶性蛋白。 (4)最后一點(diǎn)，不管是那個(gè)時(shí)期誘導(dǎo)，必然能獲得你需要的蛋白。搖瓶體系中，大腸桿菌能完全承受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，無(wú)需多慮。 |
3樓2012-12-11 14:31:10
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大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)分成兩個(gè)階段：培養(yǎng)和誘導(dǎo) (1) 培養(yǎng) 接種，30℃培養(yǎng)，待OD600nm=2-3，或者1-2時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。接種量千分之五。培養(yǎng)時(shí)間7-8h或者5-6h。 (2)誘導(dǎo) 30℃誘導(dǎo)，即下班前或者17點(diǎn)左右誘導(dǎo)。誘導(dǎo)是overnight。37℃菌體生長(zhǎng)最快，各種酶活性最好，因此誘導(dǎo)時(shí)間短。但是37℃絕大部分都是包涵體，除非你做包涵體復(fù)興。 (3)30℃培養(yǎng)是為了和誘導(dǎo)溫度一致，降溫太多對(duì)菌體活力有負(fù)面的影響，特別是溫度降低5℃以下時(shí)。再加上你誘導(dǎo)產(chǎn)生的代謝負(fù)荷，因此不建議培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)溫度相差太大。 (4) 這些都是我們的經(jīng)驗(yàn)和理論總結(jié)。 |
8樓2012-12-18 17:09:16
czdaeq
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首先，IPTG濃度誘導(dǎo)一般可以在對(duì)數(shù)初期（OD,得需要你測(cè)生長(zhǎng)曲線(xiàn)再定了）進(jìn)行，這個(gè)時(shí)候菌體活性不錯(cuò)，扛得��；但是對(duì)于一些特殊要求的實(shí)驗(yàn)，比如表達(dá)的基因?qū)τ诘孜锏睦煤荜P(guān)鍵，那么需要一接種就誘導(dǎo)，要不然漲不起來(lái)的（但是這類(lèi)一般就采用組成型，不用誘導(dǎo)型了）。 IPTG濃度，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)每種質(zhì)粒（比如PUC18在MCS區(qū)插基因）都只需要探索一次即可（有的載體有的基因型最適表達(dá)量是不同滴）； 至于條件的摸索，一般先按文獻(xiàn)試試，只有不如人意時(shí)，才摸索看看有沒(méi)有改進(jìn)，一般不是一上來(lái)就做這么多滴！ |
2樓2012-12-11 10:09:15
applexixixi
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7樓2012-12-18 16:54:14
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pUC18可用于表達(dá)么？據(jù)說(shuō)多克隆位點(diǎn)前沒(méi)有啟動(dòng)子，如果自己的序列有啟動(dòng)子應(yīng)該沒(méi)太大問(wèn)題吧？沒(méi)試過(guò)，所以不敢說(shuō)太滿(mǎn)。 菌濃度一般在OD600=0.4~0.8之間，我比較喜歡用0.4-0.6 終濃度1mM，不行再優(yōu)化，如果是過(guò)夜培養(yǎng)，降低IPTG濃度到0.5或0.25mM都沒(méi)問(wèn)題 誘導(dǎo)時(shí)間一般6~24h，一般就先12h試試，確定能翻譯再做優(yōu)化。 |
4樓2012-12-11 15:13:58
sxxuan
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