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applexixixi木蟲 (小有名氣)
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[求助]
IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的問題
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各位朋友，有誰做過大腸桿菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)？我有一些問題想咨詢一下。 1，是不是一定要把大腸培養(yǎng)到對數(shù)期再加IPTG誘導(dǎo)？具體OD值是多少有明確要求嗎？ 2，我的表達(dá)質(zhì)粒是pUC18加了我的目的基因，不同質(zhì)粒對IPTG誘導(dǎo)表達(dá)有什么影響嗎？我看文獻(xiàn)用pET系列的很多，這個區(qū)別大嗎？ 3，要表達(dá)不同的目的基因，誘導(dǎo)的具體條件是不是不同呢？都需要做哪些條件的優(yōu)化？比如菌的OD值，IPTG濃度，誘導(dǎo)時間都需要做嗎？ 哪位朋友有現(xiàn)成的實(shí)驗(yàn)方案最好了，希望能分享一下。 |
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sxxuan
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5樓2012-12-11 15:17:28
czdaeq
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首先，IPTG濃度誘導(dǎo)一般可以在對數(shù)初期（OD,得需要你測生長曲線再定了）進(jìn)行，這個時候菌體活性不錯，扛得住；但是對于一些特殊要求的實(shí)驗(yàn)，比如表達(dá)的基因?qū)τ诘孜锏睦煤荜P(guān)鍵，那么需要一接種就誘導(dǎo)，要不然漲不起來的（但是這類一般就采用組成型，不用誘導(dǎo)型了）。 IPTG濃度，嚴(yán)格來說每種質(zhì)粒（比如PUC18在MCS區(qū)插基因）都只需要探索一次即可（有的載體有的基因型最適表達(dá)量是不同滴）； 至于條件的摸索，一般先按文獻(xiàn)試試，只有不如人意時，才摸索看看有沒有改進(jìn)，一般不是一上來就做這么多滴！ |
2樓2012-12-11 10:09:15
【答案】應(yīng)助回帖
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30個金幣啊，可真真是不少的財物，見錢心喜了。 根據(jù)我多年IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，主要是搖瓶的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)驗(yàn)(發(fā)酵罐我們不用IPTG了)來大致地闡述一下： (1)質(zhì)粒復(fù)制，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)都是一個耗能的過程，會消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代謝負(fù)荷，抑制了宿主菌本身的生長繁殖。 (2)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)其實(shí)沒有嚴(yán)格OD600nm限定范圍，不過很多人喜歡在對數(shù)初期(OD600nm=0.3-0.6)進(jìn)行誘導(dǎo)，因?yàn)檫@個時候菌活力最高，誘導(dǎo)表達(dá)增加的負(fù)荷完全承受的住，并且菌體這個時候不會產(chǎn)生大量的副代謝產(chǎn)物，因此有利于產(chǎn)物表達(dá)和菌體繁殖。 (3)個人喜歡在對數(shù)后期或者平穩(wěn)期(OD600nm=2-3)誘導(dǎo)表達(dá)。對數(shù)初期誘導(dǎo)表達(dá)菌量不高，IPTG濃度相對較高，增加的負(fù)荷較大，因此最終誘導(dǎo)完畢菌體量較低，大概2-3左右。對數(shù)后期誘導(dǎo)菌體量較高，IPTG濃度相對較低，減少了負(fù)荷，最終菌體量較高。最重要的是對數(shù)后期誘導(dǎo)有利于結(jié)構(gòu)蛋白 折疊，形成正確的結(jié)構(gòu)，原理可能是后期誘導(dǎo)菌體蛋白表達(dá)速率下降，菌體各種輔助蛋白折疊的產(chǎn)物較多，因而有利于獲得可溶性蛋白。 (4)最后一點(diǎn)，不管是那個時期誘導(dǎo)，必然能獲得你需要的蛋白。搖瓶體系中，大腸桿菌能完全承受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，無需多慮。 |
3樓2012-12-11 14:31:10
sxxuan
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pUC18可用于表達(dá)么？據(jù)說多克隆位點(diǎn)前沒有啟動子，如果自己的序列有啟動子應(yīng)該沒太大問題吧？沒試過，所以不敢說太滿。 菌濃度一般在OD600=0.4~0.8之間，我比較喜歡用0.4-0.6 終濃度1mM，不行再優(yōu)化，如果是過夜培養(yǎng)，降低IPTG濃度到0.5或0.25mM都沒問題 誘導(dǎo)時間一般6~24h，一般就先12h試試，確定能翻譯再做優(yōu)化。 |
4樓2012-12-11 15:13:58
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