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[交流] 關(guān)于IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的幾個(gè)問(wèn)題

1，當(dāng)培養(yǎng)條件中有葡萄糖時(shí)，IPTG是否可以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)？會(huì)不會(huì)存在葡萄糖效應(yīng)？
2，被IPTG誘導(dǎo)的菌體是否可以在繼續(xù)分裂繁殖，如果可以，那么繁殖的下一代是可以直接表達(dá)目的蛋白，還是需要額外的一分子IPTG誘導(dǎo)后才能表達(dá)。
3，IPTG結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)像發(fā)生改變，所以才能誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，那么IPTG使阻遏蛋白構(gòu)象變化后，是一直結(jié)合在阻遏蛋白上，還是脫落下來(lái)再去結(jié)合別的阻遏蛋白？

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1樓 2014-11-16 08:17:30

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3樓: Originally posted by guoliwang at 2014-11-16 10:25:14
我的簡(jiǎn)單理解，希望對(duì)樓主有幫助，不正之處請(qǐng)大家指教。

1.培養(yǎng)基中有葡萄糖，IPTG還是能誘導(dǎo)葡萄糖表達(dá)的，很多培養(yǎng)基里都含葡萄糖的。至于會(huì)不會(huì)有葡萄糖效應(yīng)，就比較復(fù)雜，細(xì)菌內(nèi)cAMP濃度應(yīng)該受多種因素影響， ...

1，也就是說(shuō)，在誘導(dǎo)期間，菌體密度會(huì)一直增加，所以還需要一直補(bǔ)充IPTG，用于誘導(dǎo)那些新繁殖出來(lái)的菌體。
2，在搖瓶中，初始誘導(dǎo)菌體密度是0.6，加0.1mM的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，OD值在5左右。那也就是說(shuō)，一開(kāi)始加入的0.1的IPTG就是過(guò)量的，多余的IPTG用于誘導(dǎo)新增殖的菌體。
3，如果是在發(fā)酵罐里，通過(guò)補(bǔ)料菌體密度會(huì)更高，也就是需要加入更多的IPTG，需要更長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間了。
4，能詳細(xì)介紹一下葡萄糖對(duì)IPTG誘導(dǎo)的影響嗎。

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4樓2014-11-17 22:15:32

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2樓2014-11-16 09:01:13

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zcqh27: 金幣+10 2014-11-17 22:02:29

我的簡(jiǎn)單理解，希望對(duì)樓主有幫助，不正之處請(qǐng)大家指教。

1.培養(yǎng)基中有葡萄糖，IPTG還是能誘導(dǎo)葡萄糖表達(dá)的，很多培養(yǎng)基里都含葡萄糖的。至于會(huì)不會(huì)有葡萄糖效應(yīng)，就比較復(fù)雜，細(xì)菌內(nèi)cAMP濃度應(yīng)該受多種因素影響，即使有葡萄糖效應(yīng)，也只是表達(dá)效率不夠高吧。
2.IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌高表達(dá)目標(biāo)蛋白，增殖會(huì)被抑制，但仍然可以增殖。增殖后的細(xì)菌當(dāng)然也需要IPTG分子進(jìn)入，結(jié)合阻遏蛋白，才能表達(dá)目標(biāo)蛋白。
3.阻遏蛋白和IPTG結(jié)合后，不能結(jié)合在啟動(dòng)子區(qū)，目標(biāo)蛋白可以表達(dá)。如果IPTG脫落，阻遏蛋白就可以重新結(jié)合DNA,阻遏蛋白表達(dá)。原則上分子間相互作用是動(dòng)態(tài)的，IPTG與阻遏蛋白的結(jié)合解離也應(yīng)該是動(dòng)態(tài)的。雖然沒(méi)查過(guò)，IPTG應(yīng)該是結(jié)合阻遏蛋白容易，解離難吧，當(dāng)然如果該阻遏蛋白老化被降解，IPTG一定是被釋放，再結(jié)合其它阻遏蛋白。

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3樓2014-11-16 10:25:14

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4樓: Originally posted by zcqh27 at 2014-11-17 22:15:32
1，也就是說(shuō)，在誘導(dǎo)期間，菌體密度會(huì)一直增加，所以還需要一直補(bǔ)充IPTG，用于誘導(dǎo)那些新繁殖出來(lái)的菌體。
2，在搖瓶中，初始誘導(dǎo)菌體密度是0.6，加0.1mM的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，OD值在5左右。那也就是說(shuō)，一開(kāi)始 ...

對(duì)，應(yīng)該加足量的IPCG。有人會(huì)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)比較不同IPCG濃度的蛋白表達(dá)量，找到最適IPCG誘導(dǎo)濃度。
葡萄糖和IPCG誘導(dǎo)是兩個(gè)機(jī)制。對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)，葡萄糖存在于培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度下降，沒(méi)葡萄糖存在，cAMP濃度高，CAP蛋白可結(jié)合高濃度cAMP后變構(gòu)，與lac操縱子調(diào)控序列結(jié)合，使lac的三個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。
不過(guò)IPCG誘導(dǎo)的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過(guò)改造，你感興趣可以查一下載體序列，確定有沒(méi)有CAP-cAMP結(jié)合序列�；蛘吣阒苯訂�(wèn)公司的技術(shù)支持。

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5樓2014-11-17 22:41:06

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