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linxiaolin08捐助貴賓 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于雙酶切后連接轉(zhuǎn)化，酶切驗(yàn)證切不開(kāi)。 已有3人參與
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各位蟲(chóng)友，大家好，我的目的基因是1119bp，連接體系應(yīng)該是沒(méi)問(wèn)題的，我們實(shí)驗(yàn)室用的都是25微升的體系。 第一次我做了EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)： 該做的對(duì)照我都做了，但是實(shí)驗(yàn)失敗，最后得出的結(jié)論是以下原因： 1、基因沒(méi)有加上酶切位點(diǎn)導(dǎo)致我沒(méi)切開(kāi)，連不上。2、我的連接酶失效了不好使。 連接酶不好使的可能性很小。 但是我想換一下酶，所以做了第二次試驗(yàn)： 第二次換了酶切位點(diǎn)以后我選擇的是EcoRI和SalI這兩個(gè)酶，目的基因PCR條帶沒(méi)問(wèn)題，做過(guò)單酶切，也都沒(méi)問(wèn)題，但是菌液PCR有條帶，質(zhì)粒PCR后沒(méi)有條帶，也就是說(shuō)我還是沒(méi)連上，那我分析了一下，不應(yīng)該這么湊巧是酶的問(wèn)題，是否是我設(shè)計(jì)的引物出現(xiàn)問(wèn)題，例如這段引物就是對(duì)酶切位點(diǎn)有影響導(dǎo)致切不開(kāi)，所以想換引物。但是這段序列很特別，引物也是好不容易找的，所以不到萬(wàn)不得已我是不想換引物的，各位蟲(chóng)友有什么好的建議么？ |
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linxiaolin08
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