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southern blot酶切基因組問(wèn)題 已有2人參與
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| 如題，做southern blot時(shí)，在酶切基因組的時(shí)候應(yīng)該用單切還是雙酶切？看好多說(shuō)單酶切，那么單酶切之后探針結(jié)合的條帶大小為什么會(huì)和敲入的基因大小相同？單切應(yīng)該不可能正好切下來(lái)目的片段的啊 ，切下來(lái)大小不一樣跑的位置肯定不一樣的啊。。。求解！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cnzpli(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
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cnzpli(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
做southern的話(huà)，我一般都選單酶切，先利用軟件查找你要酶切堅(jiān)定的片段上下游大概5k到10k bp的序列，然后從中確定要是用的霉，因?yàn)橐粋�(gè)酶在目的基因或者目的基因其上下游都可能存在酶切位點(diǎn)，所以我的話(huà)一般都找目的基因內(nèi)沒(méi)有酶切位點(diǎn)，而在其上下游附近都存在酶切位點(diǎn)的酶，兩位點(diǎn)之間的堿基數(shù)也可知，假如為5000bp而目的基因片段為3000bp，則探針結(jié)合到酶切片段時(shí)因?yàn)榇似螢?000bp所以結(jié)果顯示為5000bp的條帶。如果你找的單酶切在目的基因和其上下游均有位點(diǎn)，例如還是5000的片段，目的基因在其中的1500到4500，你選的酶在目的基因上的第500個(gè)堿基位置進(jìn)行酶切，也就是說(shuō)目的基因分為500，和2500，因此，此5000bp的片段就分為了2000bp和3000bp的條帶，探針雖然是目的片段的全長(zhǎng)，但還是可以結(jié)合到被切割為兩段的片段上，所以檢測(cè)出來(lái)就顯示為2000和3000的條帶了。不知道以上的講解能否為樓主解惑。。。 |
2樓2014-12-03 22:02:03
3樓2014-12-04 00:48:08
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cnzpli(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-12-04 19:54:47
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cnzpli(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-12-04 19:54:47
| 一般當(dāng)然是單酶切，除非是特殊情況沒(méi)有特別好的酶切位點(diǎn)采用雙酶切。你這種不確定整合位點(diǎn)的肯定是一個(gè)酶就夠了啊。選一個(gè)你轉(zhuǎn)基因里面沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，選常用點(diǎn)的酶。這樣一般條帶都會(huì)大于你的轉(zhuǎn)基因。如果不是的話(huà)，考慮檢測(cè)下使用的酶有沒(méi)有星活性產(chǎn)生 |
4樓2014-12-04 14:21:05
5樓2014-12-04 14:28:15
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我如果沒(méi)理解錯(cuò)的話(huà)，你做的就是轉(zhuǎn)基因在小鼠基因組中的隨機(jī)整合，大小肯定是不確定的，除非你選的酶在你設(shè)計(jì)的質(zhì)粒里面有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，這樣不管整合在哪里大小都是一樣，然而southern的酶切位點(diǎn)是不應(yīng)該這么選的，質(zhì)粒中頂多只能包含一個(gè)切割位點(diǎn)（當(dāng)然這種情況你的目的條帶是可能小于轉(zhuǎn)基因大小的）。你做雜交的時(shí)候應(yīng)該加一個(gè)質(zhì)粒做對(duì)照，可以用合適的酶切質(zhì)粒，你知道包含探針靶序列的片段大小，southern條帶與預(yù)期吻合就可以驗(yàn)證探針沒(méi)問(wèn)題，那么你的樣本條帶就是可信的。 由于整合的隨機(jī)性，一般不同位點(diǎn)目的條帶不一，初步可以判斷產(chǎn)生幾個(gè)條帶就說(shuō)明發(fā)生了幾個(gè)整合。當(dāng)然也有可能不同整合的大小一樣，這時(shí)就要做標(biāo)準(zhǔn)品，做灰度定量分析了。 |
6樓2014-12-05 15:15:04
沉淀浮躁
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7樓2014-12-22 10:02:02
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