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southern blot酶切基因組問題 已有2人參與
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| 如題，做southern blot時，在酶切基因組的時候應該用單切還是雙酶切？看好多說單酶切，那么單酶切之后探針結合的條帶大小為什么會和敲入的基因大小相同？單切應該不可能正好切下來目的片段的啊 ，切下來大小不一樣跑的位置肯定不一樣的啊。。。求解！ |
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ksws0465326
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
cnzpli(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵熱心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
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cnzpli(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵熱心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
做southern的話，我一般都選單酶切，先利用軟件查找你要酶切堅定的片段上下游大概5k到10k bp的序列，然后從中確定要是用的霉，因為一個酶在目的基因或者目的基因其上下游都可能存在酶切位點，所以我的話一般都找目的基因內(nèi)沒有酶切位點，而在其上下游附近都存在酶切位點的酶，兩位點之間的堿基數(shù)也可知，假如為5000bp而目的基因片段為3000bp，則探針結合到酶切片段時因為此片段為5000bp所以結果顯示為5000bp的條帶。如果你找的單酶切在目的基因和其上下游均有位點，例如還是5000的片段，目的基因在其中的1500到4500，你選的酶在目的基因上的第500個堿基位置進行酶切，也就是說目的基因分為500，和2500，因此，此5000bp的片段就分為了2000bp和3000bp的條帶，探針雖然是目的片段的全長，但還是可以結合到被切割為兩段的片段上，所以檢測出來就顯示為2000和3000的條帶了。不知道以上的講解能否為樓主解惑。。。 |
2樓2014-12-03 22:02:03
3樓2014-12-04 00:48:08
4樓2014-12-04 14:21:05
5樓2014-12-04 14:28:15
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我如果沒理解錯的話，你做的就是轉(zhuǎn)基因在小鼠基因組中的隨機整合，大小肯定是不確定的，除非你選的酶在你設計的質(zhì)粒里面有兩個酶切位點，這樣不管整合在哪里大小都是一樣，然而southern的酶切位點是不應該這么選的，質(zhì)粒中頂多只能包含一個切割位點（當然這種情況你的目的條帶是可能小于轉(zhuǎn)基因大小的）。你做雜交的時候應該加一個質(zhì)粒做對照，可以用合適的酶切質(zhì)粒，你知道包含探針靶序列的片段大小，southern條帶與預期吻合就可以驗證探針沒問題，那么你的樣本條帶就是可信的。 由于整合的隨機性，一般不同位點目的條帶不一，初步可以判斷產(chǎn)生幾個條帶就說明發(fā)生了幾個整合。當然也有可能不同整合的大小一樣，這時就要做標準品，做灰度定量分析了。 |
6樓2014-12-05 15:15:04
7樓2014-12-22 10:02:02
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