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angelababy91新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
DNA提純遇到的問(wèn)題 已有1人參與
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本人第一次接觸分子實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在在做提取菌株的DNA的實(shí)驗(yàn)。采用了CTAB法提取菌絲的DNA，操作步驟完全按照CTAB法進(jìn)行，但是提取DNA之后用loading buffer 跑電泳檢測(cè)DNA的純度，發(fā)現(xiàn)①電泳圖DNA是兩條帶，這是因?yàn)镈NA斷裂了還是DNA中有雜質(zhì)呢？ ②DNA中的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)或RNA）該如何去除呢？具體步驟是什么呢？ ③如果將提取的DNA保存在-20度冰箱里一周之后，再使用時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA不純，現(xiàn)在還能加入RNA酶或蛋白酶嗎？那么具體加入這兩種酶的步驟是什么呢？ ④DNA的OD260/280的值在1.8-2.0之間時(shí)，跑ITS-PCR后電泳發(fā)現(xiàn)條帶不太清純，有些有拖尾現(xiàn)象，有些隱約是兩條帶，這又是為什么呢？ 我做了兩個(gè)月的實(shí)驗(yàn)了，但是還是找不到解決DNA純度的辦法，懇請(qǐng)各位大師幫我解決這四個(gè)問(wèn)題，感激不盡�。。�！ |
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angelababy91
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謝謝你的答復(fù)~我提取DNA的目的是要跑PCR來(lái)檢測(cè)菌株的遺傳多樣性，所以需要DNA純度很高。①我是用液氮研磨菌絲提取菌絲的DNA，理論上是一根帶，但是我為什么跑出來(lái)兩條帶呢？是因?yàn)镈NA斷裂還是有雜質(zhì)呢？②添加蛋白酶和RNA酶提純DNA的具體操作步驟是什么呢？添加完這兩種酶再純化，那純化的具體步驟又是什么呢？③提取完DNA后沒(méi)有檢測(cè)其純度直接放進(jìn)-20度冰箱保存一周后，再拿出來(lái)使用時(shí)檢測(cè)其純度不高，這個(gè)時(shí)候再添加蛋白酶和RNA酶還能純化DNA嗎？這兩種酶都要放嗎？怎樣檢測(cè)這兩種酶是否都需要加呢？④我只使用了CTAB法提取DNA沒(méi)有加任何酶，因?yàn)椴恢肋@兩種酶怎么加。DNA跑膠回收的具體操作步驟又是什么呢？ |
3樓2015-01-06 13:02:00
kuaile5420
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
angelababy91(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2015-01-07 16:46:59
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angelababy91(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2015-01-07 16:46:59
| 您好，可以先問(wèn)一下您提取DNA的目的何在？比如做PCR，還是進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，還是送測(cè)速？根據(jù)你的目的來(lái)確定你DNA樣品的純度要求等。根據(jù)你提供的信息，來(lái)初步回答你的問(wèn)題，①電泳圖DNA是兩條帶？提取的是全基因組嗎？如果是單純的質(zhì)�；蛘吆薉NA理論上應(yīng)該只有一條帶；②DNA中的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)或RNA）該如何去除呢？添加蛋白酶和RNA酶就可以去除，然后做個(gè)純化就可以收集到很純的DNA;③如果將提取的DNA保存在-20度冰箱里一周之后，再使用時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA不純，現(xiàn)在還能加入RNA酶或蛋白酶嗎？在存放DNA之前確定其純度，理論上應(yīng)該不會(huì)再次受到其他雜志影響的呀，還有就是如果DNA沒(méi)有發(fā)生降解，應(yīng)該可以使用上述的純化方法的，但是有個(gè)問(wèn)題要注意下反復(fù)凍融可能對(duì)DNA不好；④DNA的OD260/280的值在1.8-2.0之間時(shí)，跑ITS-PCR后電泳發(fā)現(xiàn)條帶不太清純，有些有拖尾現(xiàn)象，有些隱約是兩條帶，這又是為什么呢？這個(gè)問(wèn)題的產(chǎn)生有很多的可能性，比如，引物放久了不好用了，產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增，或者該P(yáng)CR體系中的那種物質(zhì)效果不好了，甚至有可能是操作過(guò)程 中出現(xiàn)了很低級(jí)的錯(cuò)誤（例如加酶時(shí)沒(méi)有確定是否把酶都加進(jìn)去了）。最后，我有個(gè)建議，你可以將你提取的菌絲DNA跑膠，做個(gè)膠回收，切你想要的條帶，這樣應(yīng)該可以達(dá)到你的要求。如果還滿意的話，給點(diǎn)金幣哈，嘿嘿~ |
2樓2015-01-05 22:31:26
angelababy91
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4樓2015-01-06 13:08:47
1406257228
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5樓2016-03-23 17:38:18
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