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angelababy91新蟲 (初入文壇)
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DNA提純遇到的問題 已有1人參與
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本人第一次接觸分子實驗，現(xiàn)在在做提取菌株的DNA的實驗。采用了CTAB法提取菌絲的DNA，操作步驟完全按照CTAB法進行，但是提取DNA之后用loading buffer 跑電泳檢測DNA的純度，發(fā)現(xiàn)①電泳圖DNA是兩條帶，這是因為DNA斷裂了還是DNA中有雜質(zhì)呢？ ②DNA中的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)或RNA）該如何去除呢？具體步驟是什么呢？ ③如果將提取的DNA保存在-20度冰箱里一周之后，再使用時發(fā)現(xiàn)DNA不純，現(xiàn)在還能加入RNA酶或蛋白酶嗎？那么具體加入這兩種酶的步驟是什么呢？ ④DNA的OD260/280的值在1.8-2.0之間時，跑ITS-PCR后電泳發(fā)現(xiàn)條帶不太清純，有些有拖尾現(xiàn)象，有些隱約是兩條帶，這又是為什么呢？ 我做了兩個月的實驗了，但是還是找不到解決DNA純度的辦法，懇請各位大師幫我解決這四個問題，感激不盡�。。。� |
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angelababy91
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4樓2015-01-06 13:08:47
kuaile5420
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angelababy91(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2015-01-07 16:46:59
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angelababy91(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2015-01-07 16:46:59
| 您好，可以先問一下您提取DNA的目的何在？比如做PCR，還是進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，還是送測速？根據(jù)你的目的來確定你DNA樣品的純度要求等。根據(jù)你提供的信息，來初步回答你的問題，①電泳圖DNA是兩條帶？提取的是全基因組嗎？如果是單純的質(zhì)�；蛘吆薉NA理論上應(yīng)該只有一條帶；②DNA中的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)或RNA）該如何去除呢？添加蛋白酶和RNA酶就可以去除，然后做個純化就可以收集到很純的DNA;③如果將提取的DNA保存在-20度冰箱里一周之后，再使用時發(fā)現(xiàn)DNA不純，現(xiàn)在還能加入RNA酶或蛋白酶嗎？在存放DNA之前確定其純度，理論上應(yīng)該不會再次受到其他雜志影響的呀，還有就是如果DNA沒有發(fā)生降解，應(yīng)該可以使用上述的純化方法的，但是有個問題要注意下反復(fù)凍融可能對DNA不好；④DNA的OD260/280的值在1.8-2.0之間時，跑ITS-PCR后電泳發(fā)現(xiàn)條帶不太清純，有些有拖尾現(xiàn)象，有些隱約是兩條帶，這又是為什么呢？這個問題的產(chǎn)生有很多的可能性，比如，引物放久了不好用了，產(chǎn)生了非特異性擴增，或者該PCR體系中的那種物質(zhì)效果不好了，甚至有可能是操作過程 中出現(xiàn)了很低級的錯誤（例如加酶時沒有確定是否把酶都加進去了）。最后，我有個建議，你可以將你提取的菌絲DNA跑膠，做個膠回收，切你想要的條帶，這樣應(yīng)該可以達到你的要求。如果還滿意的話，給點金幣哈，嘿嘿~ |
2樓2015-01-05 22:31:26
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謝謝你的答復(fù)~我提取DNA的目的是要跑PCR來檢測菌株的遺傳多樣性，所以需要DNA純度很高。①我是用液氮研磨菌絲提取菌絲的DNA，理論上是一根帶，但是我為什么跑出來兩條帶呢？是因為DNA斷裂還是有雜質(zhì)呢？②添加蛋白酶和RNA酶提純DNA的具體操作步驟是什么呢？添加完這兩種酶再純化，那純化的具體步驟又是什么呢？③提取完DNA后沒有檢測其純度直接放進-20度冰箱保存一周后，再拿出來使用時檢測其純度不高，這個時候再添加蛋白酶和RNA酶還能純化DNA嗎？這兩種酶都要放嗎？怎樣檢測這兩種酶是否都需要加呢？④我只使用了CTAB法提取DNA沒有加任何酶，因為不知道這兩種酶怎么加。DNA跑膠回收的具體操作步驟又是什么呢？ |
3樓2015-01-06 13:02:00
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5樓2016-03-23 17:38:18
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