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pMT-bip-GFP轉(zhuǎn)染S2細胞未見表達 已有1人參與
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最近在做果蠅的誘導表達系統(tǒng)，無法檢測到蛋白的表達。 Axygen的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pIEX-1-GFP和pMT-Bip-GFP的質(zhì)粒，濃度約為500ng/ul左右。 使用cellfectin II和Qiagen的effectence同時對pMT-bi-GFP和pIEX-1-GFP進行了轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天將細胞稀釋至1*10^6 cell/ml。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，cellfecin II和effectence都能成功轉(zhuǎn)染pIEX-1-GFP，雖然轉(zhuǎn)染效率不高（~20%），但有發(fā)熒光的細胞。 轉(zhuǎn)染一天后，對轉(zhuǎn)染pMT-bi-GFP的細胞加入10ul 100mM的CuSO4溶液至2ml培養(yǎng)基，至終濃度為500uM。 100mM CuSO4的配制為，0.25g溶解到10mL的雙蒸水。硫酸銅用的是 sigma C8027 ，http://www.sigmaaldrich.com/cata ... h®ion=CN 1d后未見發(fā)熒光細胞，直至4d后也未見熒光細胞后培養(yǎng)基熒光亮度增強（相對于對照）。收集上清和細胞，上清加入merk 的4*binding buffer至1*，純化洗脫后，跑膠�？筯is標簽的單抗，western檢測也未見條帶，遺憾的是未做陽性對照。 對pMT-bip-GFP用測序引物測序，測序結(jié)果如下： cgagagcatctggccaatgtgcatcagttgtggtcagcagcaaaatcaagtgaatcatctcagtgcaactaaagggggga tccgatctcaatatgaagttatgcatattactggccgtcgtggcctttgttggcctctcgctcgggagatctccatggcc cggggtaccggtagaaaaaatggctagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatg gtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgctacatacggaaagcttacccttaaattt atttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccg ttatccggatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctt tcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatcgtatcgagttaaaa ggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcac ggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcag accattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtcgacacaatctgcc ctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcat ggatgatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtc tcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctaag gcctgagctcgctgatcagcctcgatcgaggatccagacatgatagatac 和公布的序列有一個堿基的差異，但翻譯結(jié)果沒有受到影響。 另一點是，pIEX-1-GFP中的GFP和pMT-bip-GFP里的不一樣，pMT-bip-GFP是Cycle 3-GFP,pIEX-1-GFP里的是eGFP，序列為： MAHHHHHHHHHHSSGKETAAAKFERQHMDSPPPSGLVPRGSAGSGTIDDDDKSPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGH KFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGN YKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK. 顯微鏡的型號是Nikon DS-Ri1 光柵是 EX 450-490 DM 505 BA 520 只有這么多金幣了  ~愿散盡贊個人品……請過路的各位兄弟姐妹幫忙解救~！不甚感激~！ |
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3樓2015-01-09 23:19:48
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eric9908
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6樓2015-09-22 15:09:15
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