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moshangchenx金蟲 (正式寫手)
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[求助]
目的片段一端是粘性末端,一端是平末端與相應(yīng)載體的連接如何提高效率?急! 已有12人參與
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我最近在做一個(gè)片段與載體的連接構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒,連了很多次都沒連上. 具體如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位點(diǎn)),一端是平末端(SMA I 酶切位點(diǎn)).片段是PCR后連在T載體上測(cè)序正確,雙酶切效果可以切出兩條相應(yīng)大小的片段.載體是pDBLeu,內(nèi)含Spe I 與SMA I 酶切位點(diǎn).其雙酶切出的片段與未酶切的片段有電泳大小的區(qū)別.目的片段與載體我都雙酶切后進(jìn)行膠回收用去離子水溶解.回收產(chǎn)物電泳可看到模糊條帶. 我做了十幾次片段與載體不同濃度的連接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA連接酶進(jìn)行16度過夜連接以及用PCR儀進(jìn)行過夜變溫連接,用未酶切的pDBLeu質(zhì)粒做陽性對(duì)照.結(jié)果,陽性對(duì)照的平板上每次都產(chǎn)生很多菌落,但做連接的板上一個(gè)菌落都沒有.載體雙酶切后片段長(zhǎng)9800多bp，目標(biāo)片段為1800多bp。 做了很多次了都如此,都快做的沒信心做下去了,有哪個(gè)大哥大姐給我一些建設(shè)性意見嗎?多謝了!!! |
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moshangchenx
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3樓2015-01-12 09:18:38
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5樓2015-01-12 10:05:28
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