 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2240 | 回復(fù): 9 | ||
raohuihua新蟲 (小有名氣)
|
[求助]
粘性末端老是連接不上
|
|
小妹最近在做一個(gè)質(zhì)粒與片段粘性末端連接，體系如下： 載體6055bp 3ul 片段1758bp 4ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul PEG 4000 1ul.............................10ul，4°過夜，轉(zhuǎn)化TOP10 片段是PCR擴(kuò)增膠回收得到，載體和片段均用NcoI 酶切回收純化，沒有測(cè)濃度，但是有跑膠，亮度還行，載體是GN抗性的，片段是 tet 抗性，轉(zhuǎn)化后我分別鋪了tet 、tet+GN的板，都沒有長(zhǎng)，究竟是什么原因呢？附上我的電泳圖，有哪位大俠能夠指導(dǎo)一下？不甚感激。 后來(lái)又換了個(gè)體系，如下，還是沒有連接成功 載體6055bp 2ul 片段1758bp 5ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul ddH20 1ul................10ul w27h2626338_1404100224_785.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有208人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 粘性末端連接時(shí)長(zhǎng)問題
已經(jīng)有27人回復(fù)
- 平端酶與粘性末端酶一起使用，產(chǎn)物能否與目標(biāo)片段一起鏈接呢？
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 合成的引物直接退火形成粘性末端后連入載體
已經(jīng)有13人回復(fù)
- BamHI,SmaI平末端粘性末端連接問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- pMD19-T雙酶切，目的片段上酶切位點(diǎn)和載體上一樣
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 載體去磷酸化后大小變大
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 請(qǐng)問這個(gè)物質(zhì)中Al和O是怎么連接的？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- PCR產(chǎn)物平末端化問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 目的基因連T載體能連上，雙酶切后連不上HTB質(zhì)粒，都三個(gè)月了，糾結(jié)啊。。。
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 克隆基因?yàn)槭裁匆恢边B不到載體上
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 關(guān)于目的基因不同向連接到T載體上的問題
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 2.7Kb的片段連接問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 酶切后的補(bǔ)平連接
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 關(guān)于平末端連接
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 一個(gè)平末端和粘性末端怎樣連接比較好
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 表達(dá)載體的鏈接
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 雙酶切粘性末端連接不上
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 虛心請(qǐng)教關(guān)于平—粘末端的連接問題
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 高保真酶PCR產(chǎn)物連接pMD-19T載體，DH5a感受態(tài)，怎么總是連接不上
已經(jīng)有26人回復(fù)
- DNA片段經(jīng)過酶切后的粘性末端怎么磨平？
已經(jīng)有15人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】酶切后的粘性末端補(bǔ)平
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】質(zhì)粒跟目的基因連接不上怎么辦
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】PCR產(chǎn)物連接請(qǐng)教！
已經(jīng)有5人回復(fù)
phytoman
銀蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 6 (幼兒園)
- 金幣: 810.5
- 帖子: 214
- 在線: 117.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 537081
- 注冊(cè): 2008-03-31
- 專業(yè): 生物化學(xué)
2樓2014-07-10 00:53:32
raohuihua
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在線: 27小時(shí)
- 蟲號(hào): 2626338
- 注冊(cè): 2013-08-31
- 專業(yè): 病原微生物變異與耐藥
3樓2014-07-10 09:02:51
jamesfeng
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 46.5
- 帖子: 13
- 在線: 5.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 3314281
- 注冊(cè): 2014-07-08
- 專業(yè): 生物化學(xué)
4樓2014-07-10 11:15:28
393658000
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 18 (小學(xué)生)
- 金幣: 1627.5
- 帖子: 102
- 在線: 42小時(shí)
- 蟲號(hào): 660166
- 注冊(cè): 2008-11-22
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
raohuihua: 金幣+5, ★有幫助 2014-07-10 19:53:02
gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-16 15:50:23
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
raohuihua: 金幣+5, ★有幫助 2014-07-10 19:53:02
gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-16 15:50:23
|
你這個(gè)設(shè)計(jì)有點(diǎn)坑，主要有以下2個(gè)原因： 1.載體自連，要去檢測(cè)很容易，你鋪一個(gè)GN抗性的平板，去轉(zhuǎn)化一下就知道了，你就會(huì)知道這種單酶切的自連會(huì)有多嚴(yán)重，載體你可以做一個(gè)去磷酸化 2.你確定你PCR的時(shí)候加入了保護(hù)堿基？另外就算是你成功連接進(jìn)去了，你去篩選還得篩方向。 相關(guān)建議： 1.載體總量放的少一些，相反的片段量多一些，這樣會(huì)增加碰撞幾率，有可能會(huì)連上。 2.至于你說的Tet和Tet-GN都不長(zhǎng)，我想問一下，你的片段難道就是Tet抗性？你確定你做進(jìn)去的這一段正確表達(dá)出Tet抗性？如果確定那沒問題，如果不確定就會(huì)比較麻煩。 其他的你想知道的可以私信我 |
5樓2014-07-10 11:28:06
raohuihua
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在線: 27小時(shí)
- 蟲號(hào): 2626338
- 注冊(cè): 2013-08-31
- 專業(yè): 病原微生物變異與耐藥
6樓2014-07-10 19:30:38
jamesfeng
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 46.5
- 帖子: 13
- 在線: 5.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 3314281
- 注冊(cè): 2014-07-08
- 專業(yè): 生物化學(xué)
7樓2014-07-10 19:42:12
raohuihua
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在線: 27小時(shí)
- 蟲號(hào): 2626338
- 注冊(cè): 2013-08-31
- 專業(yè): 病原微生物變異與耐藥
|
謝謝你的建議，TET的抗性片段是我從pEX18Tc上擴(kuò)下來(lái)的，之前我?guī)熃憔褪怯眠@個(gè)片段與pJN105連接成功了，其實(shí)最開始我是想直接用我?guī)熃銟?gòu)建好的這個(gè)質(zhì)粒（pJN105-TET）與另外一個(gè)片段連接的，連接了兩次沒連接上，我就試著用酶切鑒定了pJN105-TET，發(fā)現(xiàn)在正確的條帶之外還出現(xiàn)了另外不需要的條帶，所以我決定自己再構(gòu)建一次pJN105-TET,然后就出現(xiàn)了上述的情況。我現(xiàn)在又開始用我?guī)熃愕馁|(zhì)粒與我自己的片段做連接了，發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增片段的時(shí)候老是有非特異性條帶，之前用相同的體系模板都不會(huì)，然后就用膠回收，又連接了幾次，在GN的平板上長(zhǎng)了好多，而TET的平板上都不長(zhǎng)，很奇怪，按理說我用的雙酶切，載體不會(huì)環(huán)化，如果萬(wàn)一環(huán)化了，它同時(shí)有GN和TET抗性，不可能GN上長(zhǎng)，TET 上不長(zhǎng)��？我都納悶死了 |
8樓2014-07-10 19:49:01
raohuihua
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在線: 27小時(shí)
- 蟲號(hào): 2626338
- 注冊(cè): 2013-08-31
- 專業(yè): 病原微生物變異與耐藥
9樓2014-07-10 20:02:50
raohuihua
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在線: 27小時(shí)
- 蟲號(hào): 2626338
- 注冊(cè): 2013-08-31
- 專業(yè): 病原微生物變異與耐藥
其實(shí)還在求助當(dāng)中啦。。。。。還需要各位大俠指點(diǎn)啊
10樓2014-07-10 20:10:36
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 raohuihua 的主題更新
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +15 | 于海海海海 2026-03-19 | 15/750 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿:南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩，總分289分 +3 | @taotao 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +5 | pupcoco 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑（0805） +9 | 煙汐憶海 2026-03-16 | 19/950 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué) 305求調(diào)劑 +4 | FY_yy 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 司空. 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 354求調(diào)劑 +4 | Tyoumou 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 298-一志愿中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-求調(diào)劑 +7 | 手機(jī)用戶 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料專碩306英一數(shù)二 +10 | z1z2z3879 2026-03-16 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 331求調(diào)劑（0703有機(jī)化學(xué) +7 | ZY-05 2026-03-13 | 8/400 |
|
|
|
[考研]
 0854，計(jì)算機(jī)類招收調(diào)劑
+3
|
胡辣湯放糖 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 簡(jiǎn)單點(diǎn)0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | 志存高遠(yuǎn)意在機(jī)?/a> 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +11 | zjl的號(hào) 2026-03-16 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 26考研求調(diào)劑 +6 | 丶宏Sir 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 有沒有道鐵/土木的想調(diào)劑南林，給自己招師弟中～ +3 | TqlXswl 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +5 | 時(shí)間點(diǎn) 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 東南大學(xué)364求調(diào)劑 +5 | JasonYuiui 2026-03-15 | 5/250 |
|