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raohuihua新蟲 (小有名氣)
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[求助]
粘性末端老是連接不上
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小妹最近在做一個(gè)質(zhì)粒與片段粘性末端連接，體系如下： 載體6055bp 3ul 片段1758bp 4ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul PEG 4000 1ul.............................10ul，4°過夜，轉(zhuǎn)化TOP10 片段是PCR擴(kuò)增膠回收得到，載體和片段均用NcoI 酶切回收純化，沒有測(cè)濃度，但是有跑膠，亮度還行，載體是GN抗性的，片段是 tet 抗性，轉(zhuǎn)化后我分別鋪了tet 、tet+GN的板，都沒有長(zhǎng)，究竟是什么原因呢？附上我的電泳圖，有哪位大俠能夠指導(dǎo)一下？不甚感激。 后來(lái)又換了個(gè)體系，如下，還是沒有連接成功 載體6055bp 2ul 片段1758bp 5ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul ddH20 1ul................10ul w27h2626338_1404100224_785.jpg |
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你這個(gè)設(shè)計(jì)有點(diǎn)坑，主要有以下2個(gè)原因： 1.載體自連，要去檢測(cè)很容易，你鋪一個(gè)GN抗性的平板，去轉(zhuǎn)化一下就知道了，你就會(huì)知道這種單酶切的自連會(huì)有多嚴(yán)重，載體你可以做一個(gè)去磷酸化 2.你確定你PCR的時(shí)候加入了保護(hù)堿基？另外就算是你成功連接進(jìn)去了，你去篩選還得篩方向。 相關(guān)建議： 1.載體總量放的少一些，相反的片段量多一些，這樣會(huì)增加碰撞幾率，有可能會(huì)連上。 2.至于你說(shuō)的Tet和Tet-GN都不長(zhǎng)，我想問一下，你的片段難道就是Tet抗性？你確定你做進(jìn)去的這一段正確表達(dá)出Tet抗性？如果確定那沒問題，如果不確定就會(huì)比較麻煩。 其他的你想知道的可以私信我 |
5樓2014-07-10 11:28:06
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謝謝你的建議，TET的抗性片段是我從pEX18Tc上擴(kuò)下來(lái)的，之前我?guī)熃憔褪怯眠@個(gè)片段與pJN105連接成功了，其實(shí)最開始我是想直接用我?guī)熃銟?gòu)建好的這個(gè)質(zhì)粒（pJN105-TET）與另外一個(gè)片段連接的，連接了兩次沒連接上，我就試著用酶切鑒定了pJN105-TET，發(fā)現(xiàn)在正確的條帶之外還出現(xiàn)了另外不需要的條帶，所以我決定自己再構(gòu)建一次pJN105-TET,然后就出現(xiàn)了上述的情況。我現(xiàn)在又開始用我?guī)熃愕馁|(zhì)粒與我自己的片段做連接了，發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增片段的時(shí)候老是有非特異性條帶，之前用相同的體系模板都不會(huì)，然后就用膠回收，又連接了幾次，在GN的平板上長(zhǎng)了好多，而TET的平板上都不長(zhǎng)，很奇怪，按理說(shuō)我用的雙酶切，載體不會(huì)環(huán)化，如果萬(wàn)一環(huán)化了，它同時(shí)有GN和TET抗性，不可能GN上長(zhǎng)，TET 上不長(zhǎng)��？我都納悶死了 |
8樓2014-07-10 19:49:01
raohuihua
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其實(shí)還在求助當(dāng)中啦。。。。。還需要各位大俠指點(diǎn)啊
10樓2014-07-10 20:10:36
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