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moshangchenx金蟲 (正式寫手)
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[求助]
目的片段一端是粘性末端,一端是平末端與相應(yīng)載體的連接如何提高效率?急! 已有12人參與
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我最近在做一個片段與載體的連接構(gòu)建一個質(zhì)粒,連了很多次都沒連上. 具體如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位點),一端是平末端(SMA I 酶切位點).片段是PCR后連在T載體上測序正確,雙酶切效果可以切出兩條相應(yīng)大小的片段.載體是pDBLeu,內(nèi)含Spe I 與SMA I 酶切位點.其雙酶切出的片段與未酶切的片段有電泳大小的區(qū)別.目的片段與載體我都雙酶切后進行膠回收用去離子水溶解.回收產(chǎn)物電泳可看到模糊條帶. 我做了十幾次片段與載體不同濃度的連接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA連接酶進行16度過夜連接以及用PCR儀進行過夜變溫連接,用未酶切的pDBLeu質(zhì)粒做陽性對照.結(jié)果,陽性對照的平板上每次都產(chǎn)生很多菌落,但做連接的板上一個菌落都沒有.載體雙酶切后片段長9800多bp，目標(biāo)片段為1800多bp。 做了很多次了都如此,都快做的沒信心做下去了,有哪個大哥大姐給我一些建設(shè)性意見嗎?多謝了!!! |
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-01-13 22:32:18
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-01-13 22:32:18
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目標(biāo)載體一般酶切后直接過柱純化即可，不用膠回收，膠回收損失大，且切下來的多半是多克隆位點間的小片段，純化中大多不會保留下來，對后面連接沒什么影響。目的片段也可以直接PCR獲得后酶切得到，當(dāng)然設(shè)計引物時得考慮必要的保護堿基才切得下來，也是酶切后直接過柱純化，不要膠回收。中間可以將目的片段和目的載體酶切純化后的產(chǎn)物電泳看看質(zhì)量好不好。酶連可以用燒杯盛常溫自來水，將混合的酶連體系放在燒杯中水浴，然后置于4度冰箱自然冷卻過夜。這樣差不多是水從25度左右緩慢下降至4度，多數(shù)酶連標(biāo)注16度反應(yīng)，但最佳溫度不一定是16度，水緩慢冷卻中總有一段最適溫度適合你。祝你好運！ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
16樓2015-01-13 10:04:19
moshangchenx
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2樓2015-01-12 09:08:50
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【答案】應(yīng)助回帖
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moshangchenx: 金幣+2, ★有幫助 2015-01-12 16:33:34
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| （回收產(chǎn)物電泳可看到模糊條帶）好的膠回收產(chǎn)物很清晰的。你的目的片段與載體也都沒問題，都切動了，轉(zhuǎn)化陽性的也有了，唯一的變量就是t4NDA連接酶，換新的吧，設(shè)計兩個連接體系標(biāo)準連接1;載體200NG ,目的片段184NG,T4連接酶1u了，加水到20. 2載體100NG,,,目的片段92NG,T4連接酶1u了，加水到20. 16度連接16小時，取10UL轉(zhuǎn)化200UL感受態(tài)。祝你成功。 |
9樓2015-01-12 16:07:01
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