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zb0806030銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
一端為黏性末端一端為平末端的連接方法 已有3人參與
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現(xiàn)在在做克隆，一端為PstI，一端為SmaI（平端），克隆后連接了全式金的T3載體，現(xiàn)在雙酶切片段和載體后連接不上，哪位提供點(diǎn)好的建議，謝謝！ 我用的T4連接酶是NEB的，體系10微升，4度連接過夜轉(zhuǎn)化后也不長。 |
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-11 16:52:49
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2樓2014-07-11 12:23:37
zb0806030
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2014-07-14 09:51:15
4樓2014-07-14 10:23:08
chenyhok1987
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
zb0806030(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-14 18:20:30
zb0806030(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-14 18:20:30
| 本人兩個(gè)重組質(zhì)粒都是一端平端一端粘度重組成功的，不過其中一共花費(fèi)了兩個(gè)月的時(shí)間，有些小長，總體來說這種連接方法還是蠻有難度的，一端連接效率快一端連接慢，連接反應(yīng)效率處于不平衡的狀態(tài)，難度大于雙平端連接大于雙黏端，有時(shí)候還需要一些運(yùn)氣的，其中載體和目的基因雙酶切我是采用NEB的HF版本，試劑盒采用天根回收試劑盒，最好一步使用純水洗脫，不推薦使用TE緩沖液，水是最好的溶劑，然后回收后目的基因和載體濃度都要加大一些濃度，你可以試試變換幾個(gè)濃度連接，然后我使用大連寶生物的Solution1連接酶連接的，也是16度過夜的，最好前后做了兩個(gè)重組質(zhì)粒接近兩個(gè)月吧出來的，時(shí)間比雙黏端要久一些，樓主要有耐心，按照我的方法相信你一定可以做出來的！祝您好運(yùn)~~~另外你的這個(gè)T4連接酶不適于這個(gè)連接，T4現(xiàn)在還是更適應(yīng)于雙黏端的連接！ |
5樓2014-07-14 13:44:01
moshangchenx
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6樓2015-01-12 16:43:32
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