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空談?wù)`國(guó)金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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qRT-PCR模板量應(yīng)該加多少？ 已有4人參與
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我模板cDNA不稀釋加 2ul，目的基因CT值35,36,37（平行性一點(diǎn)不好）.。。。.β-actin的ct值是18（三個(gè)復(fù)孔相差0.3以?xún)?nèi)）. 內(nèi)參挺好說(shuō)明不是操作的問(wèn)題，我在想是不是目的基因表達(dá)量低，我應(yīng)該提高模板量至4ul? 但是，我突然想到是不是我模板量加多了導(dǎo)致目的基因CT值不穩(wěn)定？請(qǐng)問(wèn)模板量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生這樣的不利影響嗎？ 還是說(shuō)我應(yīng)該把模板量提高到4ul，6ul試試？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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空談?wù)`國(guó)(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-01-28 22:04:38
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空談?wù)`國(guó)(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-01-28 22:04:38
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一，ct超過(guò)32以上就一般不能使用了，問(wèn)題可能為目的基因表達(dá)太低，你可以用普通pcr檢測(cè)以下你的摸板，是否有基因表達(dá)并且引物是否有dimer。確定過(guò)后才可上機(jī)。 二，內(nèi)參的選擇，你選擇的內(nèi)參在你的實(shí)驗(yàn)里顯然已經(jīng)不太適用了，需要重新選擇內(nèi)參，具體你需要查閱文獻(xiàn)了，并不是一個(gè)內(nèi)參用到底，不同的實(shí)驗(yàn)有不同的要求，你需要一個(gè)表達(dá)量低的內(nèi)參 基因，并且控制你的內(nèi)參和你的目的基因的ct值在10以?xún)?nèi)（也就是說(shuō)一個(gè)內(nèi)參高過(guò)20，目的低過(guò)30。） 這樣數(shù)值才可靠。 三，最好不要更改體系，變換摸班濃度以稀釋為主，不要增添。 |
4樓2015-01-28 19:04:33
2樓2015-01-28 16:32:59
空談?wù)`國(guó)
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3樓2015-01-28 18:17:10
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5樓2015-01-28 21:58:53
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6樓2015-05-02 14:15:16
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考慮引物問(wèn)題，內(nèi)參跑18說(shuō)明引物濃度夠了，目的跑35+不知道你一共多少個(gè)循環(huán)，跑到35+很可能目的基因沒(méi)有擴(kuò)增，建議用相同的protocol跑一個(gè)普通PCR看看有沒(méi)有條帶。如果引物沒(méi)有問(wèn)題那很肯能就是該基因不表達(dá)。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
7樓2016-02-14 18:10:29
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10樓2016-03-31 07:10:30
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