 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2114 | 回復: 11 | ||
抓藥的金蟲 (正式寫手)
|
[求助]
western一直做不出來，呈上實驗步驟，請大仙指教。 已有6人參與
|
|
|
一、細胞裂解 1、取24孔板每孔加100μL細胞，900μL培養(yǎng)基。待細胞長滿。 2、tofacitinib,及LDYS-14007加樣液的制備 分別取5mg tofacitinib,4.4mg LDYS-14007，各溶解在1mlDMSO中，分別制成10mmol的母液。 （1）取20μL 10mmol的母液，80μL DMSO ，制成2mmol的藥液。 （2）取10μL 2mmol的藥液,90μL DMSO制成200μmol的藥液。 （3）取10μL 200μmol的藥液,90μLDMSO制成20μmol的藥液。 （4）取10μL 20μmol的藥液,90μLDMSO制成2μmol的藥液。 （5）取10μL 2μmol的藥液,90μLDMSO制成200nmol的藥液。 然后依次標記成1-5號。 2、刺激因子的配制 取白介-11 1.5mg，溶于15ml水中，配成100μg/ml的藥液 3、實驗步驟 ①取24ml培養(yǎng)液溫浴，然后分裝到24個EP管中，將配好的Tofacitinib藥液按順序加到10個EP管中，混勻后加到24孔板上。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時（LDYS-14007同理操作） 加入溶液 終體積 終濃度 200μmol、5μL 1ml 1μmol 200μmol、1μL 1ml 200nmol 20μmol、2μL 1ml 40nmol 2μmol、 4μL 1ml 8nmol 200nmol、8μL 1ml 1.6nmol ②將1中的培養(yǎng)基吸出800μL按順序加到EP管中，除空白對照外每個管中加3μL白介-11。溫育10分鐘。 ③將培養(yǎng)基去除，加PBS洗一次。每孔加100μL SDS loading buffer。用槍頭在孔中攪拌20次（每孔相同的攪拌次數(shù)），將液體吸入到EP管，每吸一個孔換一個槍頭，按順序標記好后離心，在100度水浴10分鐘。-80冰箱保存。 二、western步驟 1、制膠：配8%的分離膠，然后加濃縮膠 2、上樣：tofacitinib處理的樣品，上樣順序（LDYS-14007同理操作） Loading buffer + 1 2 mark 3 4 5 - Loading buffer 3、電泳：濃縮膠180V，分離膠120V 4、轉膜：半干轉膜法轉膜40分鐘 5、封閉：封閉液5%BSA-TBST 1月23號配制，封閉1小時，TBST洗兩次，每次5min. 6、一抗：將每張膜在中間剪開，一半上JAK2抗體，一半上β-actin抗體 jak2 1:2000稀釋 1月26號配制，β-actin 1:3000稀釋2月2號配制 常溫過夜（忘記放4度冰箱了）。TBST洗兩次，每次5min. 7、二抗：二抗1:10000稀釋 1月27號配制，常溫2小時，TBST洗10分鐘 8、顯影：加發(fā)光液，然后壓片（15分鐘以上），洗片，重復幾次，結果片子都是空白。 |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有121人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- western blot
已經(jīng)有8人回復
- 裂解液裂解的細胞，想在做WESTERN之前測一下蛋白的濃度，應該用什么方法？
已經(jīng)有4人回復
- western一直做不出來，想測一下抗體是否失效有什么方法可以測？
已經(jīng)有6人回復
- 請教一個western blot的問題，急需答案，謝謝�。。�！
已經(jīng)有28人回復
- western blot小分子檢測不出
已經(jīng)有6人回復
- western blot 求助
已經(jīng)有9人回復
- 想檢測一個大約4kD 的小肽片段，western blot 一直沒有條帶怎么辦
已經(jīng)有21人回復
- western
已經(jīng)有3人回復
- Western Blot 經(jīng)驗
已經(jīng)有36人回復
- 大家做western blot 都用多巴胺受體1（D1R）的抗體都有哪些廠家 哪些牌子的啊
已經(jīng)有4人回復
- western的轉膜液配方
已經(jīng)有6人回復
- western實驗問題
已經(jīng)有8人回復
- 求高手解答 western 蛋白分散在泳道兩邊
已經(jīng)有3人回復
- western blot
已經(jīng)有17人回復
- western blot 一抗孵育時用多少ml啊
已經(jīng)有15人回復
- SOCS1 WESTERN
已經(jīng)有1人回復
- western結果跟考馬斯蘭，質譜結果不符合！
已經(jīng)有3人回復
- western各個條帶間有分界線or點是怎么回事
已經(jīng)有22人回復
- western-blot顯完色整個泳道都亮是怎么回事
已經(jīng)有11人回復
- 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加藥處理時間梯度？細胞數(shù)量如何統(tǒng)一？
已經(jīng)有9人回復
- western blot 遇到困難 請求幫助�。�！
已經(jīng)有6人回復
- 跪求各位高人：這個Western 到底出什么問題了啊
已經(jīng)有9人回復
- Western Blot的問題（關于重復性和顯色）
已經(jīng)有11人回復
- WESTERN跑出這樣的藍色BUFFER形狀
已經(jīng)有8人回復
- western求助
已經(jīng)有1人回復
- 【求助/交流】western blot 一直都跑不出來，不知道原因，大俠給分析一下�。�？
已經(jīng)有13人回復
6樓2015-02-04 10:09:42
yuzhoumeinv
銀蟲 (初入文壇)
- 應助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 216.1
- 帖子: 5
- 在線: 1.8小時
- 蟲號: 3084523
- 注冊: 2014-03-24
- 專業(yè): 水產(chǎn)生物營養(yǎng)與飼料學
3樓2015-02-03 19:55:39
781055707
木蟲 (著名寫手)
- 應助: 291 (大學生)
- 金幣: 3118.2
- 散金: 46
- 紅花: 19
- 帖子: 2030
- 在線: 579.3小時
- 蟲號: 3046113
- 注冊: 2014-03-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結構與功能
【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
抓藥的: 金幣+1 2015-02-04 16:44:07
抓藥的(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-02-04 20:31:06
感謝參與，應助指數(shù) +1
抓藥的: 金幣+1 2015-02-04 16:44:07
抓藥的(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-02-04 20:31:06
|
1濃縮膠180V，80v就可以了，這個太高了。 2轉膜的話你目的蛋白多大，70以下的話1小時左右,70以上就三四個小時了。 3洗滌的話一般都洗三次以上，每次7MIN以上，減小背景。 4二抗?jié)舛忍停?比2000 5做個其他蛋白的對照，檢驗下你的一抗，二抗，這東西也是會出問題的。 千里之堤毀于蟻穴，在不行，可能是你的蛋白沒表達出來，用考馬斯染下看看有無目的條帶。 |
7樓2015-02-04 10:11:21
DRMF89
新蟲 (著名寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1948.2
- 散金: 949
- 紅花: 1
- 帖子: 1154
- 在線: 192.3小時
- 蟲號: 2446794
- 注冊: 2013-05-03
- 性別: GG
- 專業(yè): 金屬材料
2樓2015-02-03 18:04:32
抓藥的
金蟲 (正式寫手)
- 應助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 1027.3
- 散金: 294
- 紅花: 23
- 帖子: 716
- 在線: 135.9小時
- 蟲號: 3052349
- 注冊: 2014-03-14
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物技術藥物
4樓2015-02-03 20:24:20
yuzhoumeinv
銀蟲 (初入文壇)
- 應助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 216.1
- 帖子: 5
- 在線: 1.8小時
- 蟲號: 3084523
- 注冊: 2014-03-24
- 專業(yè): 水產(chǎn)生物營養(yǎng)與飼料學
5樓2015-02-04 09:50:38
8樓2015-02-04 15:05:31
9樓2015-02-04 16:38:23
抓藥的
金蟲 (正式寫手)
- 應助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 1027.3
- 散金: 294
- 紅花: 23
- 帖子: 716
- 在線: 135.9小時
- 蟲號: 3052349
- 注冊: 2014-03-14
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物技術藥物
10樓2015-02-04 16:44:49
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 抓藥的 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿西南交大，求調劑 +5 | 材化逐夢人 2026-03-18 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 317求調劑 +8 | 申子申申 2026-03-19 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 295求調劑 +4 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 294求調劑材料與化工專碩 +15 | 陌の森林 2026-03-18 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 321求調劑 +9 | 何潤采123 2026-03-18 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 290求調劑 +7 | ^O^乜 2026-03-19 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 260求調劑 +3 | 朱芷琳 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 353求調劑 +3 | 拉鉤不許變 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 319求調劑 +3 | 小力氣珂珂 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 261求B區(qū)調劑，科研經(jīng)歷豐富 +3 | 牛奶很忙 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
[考研] 廣西大學家禽遺傳育種課題組2026年碩士招生（接收計算機專業(yè)調劑） +3 | 123阿標 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿西安交通大學材料工程專業(yè) 282分求調劑 +5 | 楓橋ZL 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 本科鄭州大學物理學院，一志愿華科070200學碩，346求調劑 +4 | 我不是一根蔥 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 311求調劑 +6 | 26研0 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0854可跨調劑，一作一項核心論文五項專利，省、國級證書40+數(shù)一英一287 +8 | 小李0854 2026-03-16 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 301求調劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 333求調劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 326求調劑 +4 | 諾貝爾化學獎覬?/a> 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 277材料科學與工程080500求調劑 +3 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 289求調劑 +4 | 這么名字咋樣 2026-03-14 | 6/300 |
|