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抓藥的金蟲 (正式寫手)
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[求助]
western一直做不出來，呈上實驗步驟，請大仙指教。 已有6人參與
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一、細(xì)胞裂解 1、取24孔板每孔加100μL細(xì)胞，900μL培養(yǎng)基。待細(xì)胞長滿。 2、tofacitinib,及LDYS-14007加樣液的制備 分別取5mg tofacitinib,4.4mg LDYS-14007，各溶解在1mlDMSO中，分別制成10mmol的母液。 （1）取20μL 10mmol的母液，80μL DMSO ，制成2mmol的藥液。 （2）取10μL 2mmol的藥液,90μL DMSO制成200μmol的藥液。 （3）取10μL 200μmol的藥液,90μLDMSO制成20μmol的藥液。 （4）取10μL 20μmol的藥液,90μLDMSO制成2μmol的藥液。 （5）取10μL 2μmol的藥液,90μLDMSO制成200nmol的藥液。 然后依次標(biāo)記成1-5號。 2、刺激因子的配制 取白介-11 1.5mg，溶于15ml水中，配成100μg/ml的藥液 3、實驗步驟 ①取24ml培養(yǎng)液溫浴，然后分裝到24個EP管中，將配好的Tofacitinib藥液按順序加到10個EP管中，混勻后加到24孔板上。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時（LDYS-14007同理操作） 加入溶液 終體積 終濃度 200μmol、5μL 1ml 1μmol 200μmol、1μL 1ml 200nmol 20μmol、2μL 1ml 40nmol 2μmol、 4μL 1ml 8nmol 200nmol、8μL 1ml 1.6nmol ②將1中的培養(yǎng)基吸出800μL按順序加到EP管中，除空白對照外每個管中加3μL白介-11。溫育10分鐘。 ③將培養(yǎng)基去除，加PBS洗一次。每孔加100μL SDS loading buffer。用槍頭在孔中攪拌20次（每孔相同的攪拌次數(shù)），將液體吸入到EP管，每吸一個孔換一個槍頭，按順序標(biāo)記好后離心，在100度水浴10分鐘。-80冰箱保存。 二、western步驟 1、制膠：配8%的分離膠，然后加濃縮膠 2、上樣：tofacitinib處理的樣品，上樣順序（LDYS-14007同理操作） Loading buffer + 1 2 mark 3 4 5 - Loading buffer 3、電泳：濃縮膠180V，分離膠120V 4、轉(zhuǎn)膜：半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜40分鐘 5、封閉：封閉液5%BSA-TBST 1月23號配制，封閉1小時，TBST洗兩次，每次5min. 6、一抗：將每張膜在中間剪開，一半上JAK2抗體，一半上β-actin抗體 jak2 1:2000稀釋 1月26號配制，β-actin 1:3000稀釋2月2號配制 常溫過夜（忘記放4度冰箱了）。TBST洗兩次，每次5min. 7、二抗：二抗1:10000稀釋 1月27號配制，常溫2小時，TBST洗10分鐘 8、顯影：加發(fā)光液，然后壓片（15分鐘以上），洗片，重復(fù)幾次，結(jié)果片子都是空白。 |
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781055707
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
抓藥的: 金幣+1 2015-02-04 16:44:07
抓藥的(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-02-04 20:31:06
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抓藥的(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-02-04 20:31:06
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1濃縮膠180V，80v就可以了，這個太高了。 2轉(zhuǎn)膜的話你目的蛋白多大，70以下的話1小時左右,70以上就三四個小時了。 3洗滌的話一般都洗三次以上，每次7MIN以上，減小背景。 4二抗?jié)舛忍停?比2000 5做個其他蛋白的對照，檢驗下你的一抗，二抗，這東西也是會出問題的。 千里之堤毀于蟻穴，在不行，可能是你的蛋白沒表達(dá)出來，用考馬斯染下看看有無目的條帶。 |
7樓2015-02-04 10:11:21
yuzhoumeinv
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3樓2015-02-03 19:55:39
抓藥的
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4樓2015-02-03 20:24:20
yuzhoumeinv
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5樓2015-02-04 09:50:38
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