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黃xia金蟲 (小有名氣)
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[交流]
蛋白純化問題，希望大家給我支支招，成分感謝 已有8人參與
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| 我的蛋白70多KD，上清表達(dá)，表達(dá)量還可以，在C端加了6His標(biāo)簽，用生工的Ni柱填料掛柱純化，洗脫后，洗脫液中無目的蛋白，只有雜蛋白，目的蛋白在流穿液當(dāng)中，說明沒掛上，（平衡緩沖液pH8.0，蛋白的等電點(diǎn)4.6左右，上樣流速嘗試過0.4和0.5ml/min），由于沒掛上，打算用切非變性膠的方式純化，來做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，但將切下的膠電透濃縮后，跑SDS-PAGE分析，有很多雜帶，目的條帶的量也少，與雜帶量差不多，在切的過程中，有時(shí)候還切不到自己的目的蛋白，怎么辦呀，我已經(jīng)就純化蛋白這個(gè)問題做了很久了，還沒啥進(jìn)展，希望各位有經(jīng)驗(yàn)的親給我一些建議，謝謝謝謝........無數(shù)個(gè)謝謝。 |
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-05-10 22:54:42
黃xia: 金幣+5, ★★★很有幫助, 您好，由于看到蛋白沒掛上，所以心情受到重創(chuàng)就完全忘了拍照，在配平衡緩沖液的時(shí)候的確沒有加任何咪唑(50mMNaH2PO4·2H2O,300mMNaCl,NaOH調(diào)pH至8.0)，您提醒我了，我配20mMTris-HCl 時(shí)用了HCl和NaCl調(diào)pH值，難道是NaCl把蛋白沉淀掉了？我沒考慮過，也不太懂，柱子是沒問題，因?yàn)槠渌擞媚侵幽軖焐�，樣品自身是否聚合我不知道，不過謝謝你的建議，我會(huì)考慮加變性劑試試，也檢測一下histag，真得非常感謝 2015-05-11 09:05:52
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-05-10 22:54:42
黃xia: 金幣+5, ★★★很有幫助, 您好，由于看到蛋白沒掛上，所以心情受到重創(chuàng)就完全忘了拍照，在配平衡緩沖液的時(shí)候的確沒有加任何咪唑(50mMNaH2PO4·2H2O,300mMNaCl,NaOH調(diào)pH至8.0)，您提醒我了，我配20mMTris-HCl 時(shí)用了HCl和NaCl調(diào)pH值，難道是NaCl把蛋白沉淀掉了？我沒考慮過，也不太懂，柱子是沒問題，因?yàn)槠渌擞媚侵幽軖焐�，樣品自身是否聚合我不知道，不過謝謝你的建議，我會(huì)考慮加變性劑試試，也檢測一下histag，真得非常感謝 2015-05-11 09:05:52
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5樓2015-05-10 19:13:25
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黃xia: 金幣+5, 謝謝 2015-05-10 11:03:13
silicare: 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔 2016-01-12 15:37:16
黃xia: 金幣+5, 謝謝 2015-05-10 11:03:13
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2樓2015-05-09 22:49:39
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10樓2015-05-11 11:13:28
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