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緣來是伊木蟲 (小有名氣)
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[交流]
誰有做電轉(zhuǎn)化時(shí)E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備的操作步驟的資料？求分享，謝謝！
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| 由于電轉(zhuǎn)化效率比較高，我的質(zhì)粒比較大，想用電轉(zhuǎn)化，誰有做電轉(zhuǎn)化時(shí)E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備的操作步驟的資料？求分享，謝謝！ |
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2樓2015-05-14 19:23:32
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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用氯化鈣制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 大腸桿菌E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法進(jìn)行 1. 緩沖液和溶液： ①CaCl2 •2H2O（1mol/L） 注：制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取出10ml貯存液加90ml純水稀釋至100ml，用預(yù)處理的Nalgene 濾膜（0.45um孔徑）過濾除菌，放置冰上。 ② CaCl2-MgCl2溶液冰上預(yù)冷 2. 培養(yǎng)基 ①LB 液體LB培養(yǎng)基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L；酵母提取物(Yeast extract) 5g/L；氯化鈉(NaCl) 10g/L 搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解（或加熱攪拌）.用5mol/L NaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH,使其達(dá)到7.0(該pH適合目前使用最廣的原核表達(dá)菌種E.coli的生長(zhǎng))，在15psi（1.05Kg/cm2=103kPa）,121.3℃蒸汽滅菌20min。 固體加15g瓊脂粉（若不易溶解時(shí)，不斷加熱攪拌） 抗生素的加入：高壓滅菌后，將融化的LB固體培養(yǎng)基置于55℃的水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到55℃時(shí)（手可觸摸）加入抗生素，以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。 ②SOC 除加入20mmol/L葡萄糖外，其他成分與SOB培養(yǎng)基相同。SOB培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌后冷卻至60℃或60℃以下，加20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液（1mol/L葡萄糖溶液的配制方法是：用90mL去離子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去離子水（蒸餾水）定容至100ml,用0.22um氯氣過濾除菌）。 SOB培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，在950ml去離子水（蒸餾水）中加入：胰化蛋白胨 20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g 搖動(dòng)溶液是溶質(zhì)完全溶解。加10ml 250mmol/L KCl溶液（將1.86gKCl用100mL去離子水溶解即配成250mmol/L的KCl溶液）。用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH,使其達(dá)到7.0。用去離子水定容至1L。在15psi高壓下蒸汽滅菌20min。該溶液在使用前，加入5mL滅菌的2mol/L的MgCl2(90ml去離子水溶解19g MgCl2，用去離子水調(diào)整體積為100ml，在15psi高壓下整齊滅菌20min) 3.實(shí)驗(yàn)過程 A：用接種環(huán)取少量細(xì)菌保存液接種，37℃培養(yǎng)16-20h B：取大腸桿菌DH5a單菌落，接種于5mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜 C：取0.5mL上述過夜培養(yǎng)物，按1：100的稀釋比例倒入20mL LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)3-4h。 注：為達(dá)到高的轉(zhuǎn)化效率，活細(xì)胞數(shù)目務(wù)必小于108個(gè)/L，對(duì)大多數(shù)大腸桿菌來說，這相當(dāng)于OD600值為0.4左右。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)密度不致過高，可每隔15-20min測(cè)定OD600來監(jiān)控，用監(jiān)控的時(shí)間及OD600值列一個(gè)圖表，以便預(yù)測(cè)培養(yǎng)物的OD600值達(dá)到0.4的時(shí)間，當(dāng)OD值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。 不同菌株的OD值與活菌數(shù)關(guān)系差異很大，因此有必要測(cè)定所用菌株的對(duì)應(yīng)關(guān)系。以LB瓊脂平板計(jì)算每一時(shí)刻的細(xì)菌活菌數(shù)，從而是分光光度計(jì)的讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。 D：將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50mL無菌離心管中，冰浴30min，使菌液冷卻至0℃，于4℃4000r／min離心10min，棄上清液（培養(yǎng)液倒出后，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡） D：每50ml初始培養(yǎng)液用30ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液（80mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2），即每支離心管沉淀中加入30mL冰浴的CaCl2-MgCl2溶液，重懸每份細(xì)胞沉淀。 E：于4℃ 4100r／min離心10min，棄上清液（培養(yǎng)液倒出后，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡）以回收細(xì)胞 F：每50ml初始培養(yǎng)液用2ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液重懸每份細(xì)胞沉淀即每支離心管沉淀中加入2mL冰浴的CaCl2溶液。 G：分裝后于液氮中迅速冷凍，置-70℃冰箱中，長(zhǎng)期保存，也可立即使用 |
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緣來是伊3樓2015-05-15 09:58:46
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