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新蟲 (小有名氣)

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蟲號: 2180135
注冊: 2012-12-11
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專業(yè): 生物海洋學(xué)與海洋生物資源

[求助] CODEHOP 結(jié)果怎么看以及簡并引物設(shè)計(jì)相關(guān)問題已有2人參與

CODEHOP 結(jié)果怎么看？
下面是我用CODEHOP設(shè)計(jì)簡并引物的結(jié)果，1、不知道怎么選擇，A、B、C、D、中哪個(gè)是上游引物，哪個(gè)是下游引物？怎么知道簡并引物之間的距離？引物的選擇有什么要求？
另外2、在BLOCKMAKE 時(shí)輸入的蛋白序列是全長?還是找到保守區(qū)域后的序列？
3、在CODEHOP階段，沒有本物種的密碼子表，選擇跟本物種不同目的物種可以嗎？
4、篩選出引物之后還需要做哪些工作，需不需要驗(yàn)證引物？怎么驗(yàn)證？
求各位大師知道，感激不盡！
CODEHOP Results

Oligo Summary Not all overlapping primers are shown

Warning: All weights in the block were less than or equal to zero.
Warning: Computing position-based sequence weights.

CODEHOP Version 10/14/04.1
COPYRIGHT 1997-2004, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA

Parameters:
Amino acids PSSM calculated with odds ratios normalized to 100
and back-translated with Standard genetic code
and codon usage table "../docs/shrimp.codon.use"
Maximum core degeneracy 128 Core strictness 0.00
Clamp strictness 1.00 Target clamp temperature 60.00 C
DNA Concentration 50.00 nM Salt Concentration 50.00 mM
Codon boundary 0 Most common codon 0
Verbose 0 Output 3
Begin 1 PolyX 5
Suggested CODEHOPS: The degenerate region (core) is printed in lower case,
the non-degenerate region (clamp) is printed in upper case.

Block unknown__A
Oligos

W  G  R  P  E  D  M  T  M  D  R  P  S  W  K  I  D  S  E  A  P  G  T  D  L  A  A  E  T  A  A  A  L  A  A  A  S  I  V  F  Q  D
                                                                  GACCTGGCCGCCgaracngcngc -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=72, len=12 temp= 61.6
                                                            GCACCGACCTGGCCgsngaracngc -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=76, len=14 temp= 63.7
                                                            CGGCACCGACCTGgcngsngarac -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=74, len=13 temp= 63.7
                     TGGACCGGCCCTGCkrbaarathga -3'  Core: degen=72 len=11  Clamp: score=65, len=14 temp= 61.5
  GGGCCGGCCCgarganatgac -3'  Core: degen=8 len=11  Clamp: score=71, len=10 temp= 62.6
TGGGGCCGGCCngarganatga -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=80, len=11 temp= 57.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
TGGGGCCGGccngarganatg -3'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=70, len=9 temp= 57.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
TGGGGCCGGccngarganat -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=70, len=9 temp= 57.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Complement of Block unknown__A
Oligos

W  G  R  P  E  D  M  T  M  D  R  P  S  W  K  I  D  S  E  A  P  G  T  D  L  A  A  E  T  A  A  A  L  A  A  A  S  I  V  F  Q  D
      ggnctyctntaCTGGTACCTGGCCGG -5'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=78, len=15 temp= 62.8
      gnctyctntactGGTACCTGGCCGG -5'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=71, len=13 temp= 62.8
         ctyctntactgGTACCTGGCCGG -5'  Core: degen=8 len=11  Clamp: score=66, len=12 temp= 62.8
                                       ttytadctrhbGCTCCTGGGGCCGT -5'  Core: degen=108 len=11  Clamp: score=57, len=14 temp= 61.5
                                                                        cgncsnctytgGCGGCGGCGG -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=75, len=10 temp= 62.9
                                                                           csnctytgncgGCGGCGGGAC -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=73, len=10 temp= 60.6
                                                                              ctytgncgncgGCGGGACCGGC -5'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=71, len=11 temp= 65.1

Block unknown__B
Oligos

W  Q  D  E  L  P  W  G  A  C  W  L  Y  R  A  T  G  E  E  S  Y  M  T  Q  A  Q  G  Y  I  E  E  F  G  F
                        GCTGGCTGTACCGGgcnacnggnga -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=72, len=14 temp= 61.4
            GGCCTGGGGCGCCykntggytnta -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=74, len=13 temp= 63.7
         TGGCCTGGGGCgcnykntggyt -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=71, len=11 temp= 62.8
TGGsangaygaryt -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=66, len=3 temp=-100.4 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Complement of Block unknown__B
Oligos

W  Q  D  E  L  P  W  G  A  C  W  L  Y  R  A  T  G  E  E  S  Y  M  T  Q  A  Q  G  Y  I  E  E  F  G  F
               acccsncgnrmGACCGACATGGCCCGG -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=82, len=16 temp= 61.3
                     cgnrmnaccraCATGGCCCGGTGGC -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=73, len=14 temp= 61.1
                                       cgntgnccnctCCTCCGGATGAACTGGCT -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=61, len=18 temp= 61.7

Block unknown__C
Oligos

N  F  D  W  D  D  K  T  A  G  C  Y  A  L  M  A  E  L  D
AACTTCGACtgggaygwnaa -3'  Core: degen=16 len=11  Clamp: score=77, len=9 temp= 43.3 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
AACTTCGAytgggaygwna -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=80, len=8 temp= 1.2 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
AACTTnkaytgggayg -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=82, len=5 temp=-50.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
AACktnkaytggga -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=77, len=3 temp=-118.0 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Complement of Block unknown__C
Oligos

N  F  D  W  D  D  K  T  A  G  C  Y  A  L  M  A  E  L  D
anmtraccctrcTGTTCTGGCGGCCGA -5'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=75, len=15 temp= 61.0
   traccctrcwntTCTGGCGGCCGACG -5'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=72, len=14 temp= 62.2
      accctrcwnttCTGGCGGCCGACG -5'  Core: degen=16 len=11  Clamp: score=68, len=13 temp= 62.2

Block unknown__D
Oligos

T  P  L  G  M  I  Y  I  M  D  W  G  S  L  R  H  A  M  N  V  A  F  I  A  A  R  A  A  S  L  G  I  D  T  E  E  Y  N
                                          GCACGCCATGAACGTGgsnttyrtngc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=69, len=16 temp= 63.5

Complement of Block unknown__D
Oligos

T  P  L  G  M  I  Y  I  M  D  W  G  S  L  R  H  A  M  N  V  A  F  I  A  A  R  A  A  S  L  G  I  D  T  E  E  Y  N
                                                         csnaaryancgGCAGGCCCGGC -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=56, len=11 temp= 64.9

Block unknown__E
Oligos

N  W  A  Q  T  Q  I  D  Y  A  L  G  S  T  G  H  S  Y  M  C  G  F  G  E  N  P  P
                                                   TGTGCGGCTTCGGCrmnaayccncc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=80, len=14 temp= 60.2
                                                ACATGTGCGGCTTCggnrmnaaycc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=80, len=14 temp= 60.4
                                          CACTCCTACATGTGCGGCttyggnrmnaa -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=74, len=18 temp= 61.3
                                 CCATGGGCCACTCCTACATGkknggnttygg -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=73, len=20 temp= 63.6
   GCCCAGACCCAGATCgaytayrcnbt -3'  Core: degen=96 len=11  Clamp: score=76, len=15 temp= 60.8
TGGGCCCAGACCCAGryngaytayrc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=78, len=15 temp= 60.1
  CTGGGCCCAGACCcarryngayta -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=73, len=13 temp= 60.1

Complement of Block unknown__E
Oligos

N  W  A  Q  T  Q  I  D  Y  A  L  G  S  T  G  H  S  Y  M  C  G  F  G  E  N  P  P
            gtyyrnctratGCGGGACCCGAGGT -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=69, len=14 temp= 62.5
                  ctratrygnvaCCCGAGGTACCCGG -5'  Core: degen=96 len=11  Clamp: score=66, len=14 temp= 62.8
                                                         ccnaarccnykCTTGGGTGGT -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=78, len=10 temp= 27.1 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
                                                            aarccnyknttGGGTGGT -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=80, len=7 temp= 21.1 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
                                                               ccnyknttrggTGGT -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=66, len=4 temp=-14.8 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Block unknown__

X  M  K  A  W  I  D  M  P  M  L  V  P  F  D  F  Y  D  Q  E  Y  P  G  C  D  G  C  G  M  T  P  Y  D  Y  Y  Q  Y  S
No suggested primers found.

Complement of Block unknown__

X  M  K  A  W  I  D  M  P  M  L  V  P  F  D  F  Y  D  Q  E  Y  P  G  C  D  G  C  G  M  T  P  Y  D  Y  Y  Q  Y  S
No suggested primers found.
Oligos

Degenerate alphabet
Block unknown__A
      W  G  R  P  E  D  M
oligo:5'-TGGGGCCGGccngarganat-3' degen=32 temp=57.5 Extend clamp
      W  G  R  P  E  D  M
oligo:5'-TGGGGCCGGccngarganatg-3' degen=32 temp=57.5 Extend clamp
      W  G  R  P  E  D  M  T
oligo:5'-TGGGGCCGGCCngarganatga-3' degen=32 temp=57.5 Extend clamp
      G  R  P  E  D  M  T
oligo:5'-GGGCCGGCCCgarganatgac-3' degen=8 temp=62.6
         D  R  P  S  W  K  I  D
oligo:5'-TGGACCGGCCCTGCkrbaarathga-3' degen=72 temp=61.5
      G  T  D  L  A  A  E  T
oligo:5'-CGGCACCGACCTGgcngsngarac-3' degen=64 temp=63.7
         T  D  L  A  A  E  T  A
oligo:5'-GCACCGACCTGGCCgsngaracngc-3' degen=64 temp=63.7
      D  L  A  A  E  T  A  A
oligo:5'-GACCTGGCCGCCgaracngcngc-3' degen=32 temp=61.6
Complement of Block unknown__A
P  E  D  M  T  M  D  R  P
ggnctyctntaCTGGTACCTGGCCGG oligo:5'-GGCCGGTCCATGGTCatntcytcngg-3' degen=32 temp=62.8
  E  D  M  T  M  D  R  P
gnctyctntactGGTACCTGGCCGG oligo:5'-GGCCGGTCCATGGtcatntcytcng-3' degen=32 temp=62.8
E  D  M  T  M  D  R  P
ctyctntactgGTACCTGGCCGG oligo:5'-GGCCGGTCCATGgtcatntcytc-3' degen=8 temp=62.8
K  I  D  S  E  A  P  G  T
ttytadctrhbGCTCCTGGGGCCGT oligo:5'-TGCCGGGGTCCTCGbhrtcdatytt-3' degen=108 temp=61.5
A  A  E  T  A  A  A
cgncsnctytgGCGGCGGCGG oligo:5'-GGCGGCGGCGgtytcnscngc-3' degen=64 temp=62.9
A  E  T  A  A  A  L
csnctytgncgGCGGCGGGAC oligo:5'-CAGGGCGGCGgcngtytcnsc-3' degen=64 temp=60.6
E  T  A  A  A  L  A  A
ctytgncgncgGCGGGACCGGC oligo:5'-CGGCCAGGGCGgcngcngtytc-3' degen=32 temp=65.1
Block unknown__B
      W  Q  D  E  L
oligo:5'-TGGsangaygaryt-3' degen=64 temp=-100.4 Extend clamp
         P  W  G  A  C  W  L
oligo:5'-TGGCCTGGGGCgcnykntggyt-3' degen=128 temp=62.8
      P  W  G  A  C  W  L  Y
oligo:5'-GGCCTGGGGCGCCykntggytnta-3' degen=128 temp=63.7
         W  L  Y  R  A  T  G  E
oligo:5'-GCTGGCTGTACCGGgcnacnggnga-3' degen=64 temp=61.4
Complement of Block unknown__B
W  G  A  C  W  L  Y  R  A
acccsncgnrmGACCGACATGGCCCGG oligo:5'-GGCCCGGTACAGCCAGmrngcnsccca-3' degen=128 temp=61.3
A  C  W  L  Y  R  A  T  G
cgnrmnaccraCATGGCCCGGTGGC oligo:5'-CGGTGGCCCGGTACarccanmrngc-3' degen=128 temp=61.1
A  T  G  E  E  S  Y  M  T  Q
cgntgnccnctCCTCCGGATGAACTGGCT oligo:5'-TCGGTCAAGTAGGCCTCCtcnccngtngc-3' degen=64 temp=61.7
Block unknown__C
      N  F  D  W  D
oligo:5'-AACktnkaytggga-3' degen=32 temp=-118.0 Extend clamp
      N  F  D  W  D  D
oligo:5'-AACTTnkaytgggayg-3' degen=32 temp=-50.5 Extend clamp
      N  F  D  W  D  D  K
oligo:5'-AACTTCGAytgggaygwna-3' degen=32 temp=1.2 Extend clamp
      N  F  D  W  D  D  K
oligo:5'-AACTTCGACtgggaygwnaa-3' degen=16 temp=43.3 Extend clamp
Complement of Block unknown__C
  D  W  D  D  K  T  A  G  C
anmtraccctrcTGTTCTGGCGGCCGA oligo:5'-AGCCGGCGGTCTTGTcrtcccartmna-3' degen=32 temp=61.0
  W  D  D  K  T  A  G  C
traccctrcwntTCTGGCGGCCGACG oligo:5'-GCAGCCGGCGGTCTtnwcrtcccart-3' degen=32 temp=62.2
W  D  D  K  T  A  G  C
accctrcwnttCTGGCGGCCGACG oligo:5'-GCAGCCGGCGGTCttnwcrtccca-3' degen=16 temp=62.2
Block unknown__D
      H  A  M  N  V  A  F  I  A
oligo:5'-GCACGCCATGAACGTGgsnttyrtngc-3' degen=128 temp=63.5
Complement of Block unknown__D
A  F  I  A  A  R  A  A
csnaaryancgGCAGGCCCGGC oligo:5'-CGGCCCGGACGgcnayraansc-3' degen=128 temp=64.9
Block unknown__E
      W  A  Q  T  Q  I  D  Y
oligo:5'-CTGGGCCCAGACCcarryngayta-3' degen=64 temp=60.1
      W  A  Q  T  Q  I  D  Y  A
oligo:5'-TGGGCCCAGACCCAGryngaytayrc-3' degen=128 temp=60.1
      A  Q  T  Q  I  D  Y  A  L
oligo:5'-GCCCAGACCCAGATCgaytayrcnbt-3' degen=96 temp=60.8
         T  G  H  S  Y  M  C  G  F  G
oligo:5'-CCATGGGCCACTCCTACATGkknggnttygg-3' degen=128 temp=63.6
      H  S  Y  M  C  G  F  G  E  N
oligo:5'-CACTCCTACATGTGCGGCttyggnrmnaa-3' degen=128 temp=61.3
         M  C  G  F  G  E  N  P
oligo:5'-ACATGTGCGGCTTCggnrmnaaycc-3' degen=128 temp=60.4
         C  G  F  G  E  N  P  P
oligo:5'-TGTGCGGCTTCGGCrmnaayccncc-3' degen=128 temp=60.2
Complement of Block unknown__E
Q  I  D  Y  A  L  G  S  T
gtyyrnctratGCGGGACCCGAGGT oligo:5'-TGGAGCCCAGGGCGtartcnryytg-3' degen=64 temp=62.5
D  Y  A  L  G  S  T  G  H
ctratrygnvaCCCGAGGTACCCGG oligo:5'-GGCCCATGGAGCCCavngyrtartc-3' degen=96 temp=62.8
G  F  G  E  N  P  P
ccnaarccnykCTTGGGTGGT oligo:5'-TGGTGGGTTCkynccraancc-3' degen=128 temp=27.1 Extend clamp
F  G  E  N  P  P
aarccnyknttGGGTGGT oligo:5'-TGGTGGGttnkynccraa-3' degen=128 temp=21.1 Extend clamp
G  E  N  P  P
ccnyknttrggTGGT oligo:5'-TGGTggrttnkyncc-3' degen=128 temp=-14.8 Extend clamp

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求高手幫忙設(shè)計(jì)引物，急急急��！已經(jīng)有6人回復(fù)
引物設(shè)計(jì)后，看引物的特異性已經(jīng)有8人回復(fù)
關(guān)于簡并引物設(shè)計(jì)問題已經(jīng)有5人回復(fù)
引物設(shè)計(jì)——下游引物是否需要考慮閱讀框問題已經(jīng)有6人回復(fù)
如何通過設(shè)計(jì)引物，插入三個(gè)新的DNA堿基已經(jīng)有4人回復(fù)
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關(guān)于基因測序引物的設(shè)計(jì) 已經(jīng)有7人回復(fù)
求助，CODEHOP 設(shè)計(jì)的簡并引物結(jié)果怎么選取~ 已經(jīng)有7人回復(fù)
特異性Promoter引物該怎么設(shè)計(jì)啊已經(jīng)有6人回復(fù)
引物設(shè)計(jì)區(qū)域選擇問題已經(jīng)有7人回復(fù)
引物設(shè)計(jì)的問題已經(jīng)有6人回復(fù)
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——CODEHOP簡并引物設(shè)計(jì)程序的疑惑已經(jīng)有9人回復(fù)
【求助/交流】緊急求助~~ 關(guān)于簡并引物設(shè)計(jì) codehop 和genefisher 在線已經(jīng)有12人回復(fù)
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1樓 2015-05-20 16:45:16

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308047410: 金幣+15, ★★★很有幫助 2015-05-23 10:19:19

1.CODEHOP會根據(jù)每個(gè)block區(qū)同時(shí)設(shè)計(jì)上游引物及下游引物，你截圖中Block unknown__A Oligos下方的5‘→3’的序列就是上游引物；再往下Complement of Block unknown__A Oligos下方的3‘→5’的序列就是下游引物。簡并引物之間的距離可根據(jù)block區(qū)的位置信息估算，做完blockmake后，可看到每個(gè)block的位置信息。引物選擇依據(jù)：上游引物在靠前的block中找，下游引物在靠后的block中找，引物間距離也就是產(chǎn)物大小不建議太長，因?yàn)楹啿⒁颬CR本身效率就較低，所以一般產(chǎn)物大小選擇200-600bp（這是我的經(jīng)驗(yàn)值，不一定對）。
2.做blockmake時(shí)，用的是全長蛋白質(zhì)序列，這一步工作實(shí)際就是通過做多序列比對找到多序列間的保守區(qū)。
3.沒有本物種密碼子使用偏性表就使用親緣關(guān)系近的，同科或同目或同綱。
4.篩出引物，最好的驗(yàn)證方法就是做PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是檢驗(yàn)引物好壞的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

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9樓2015-05-23 01:08:48

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求回復(fù)�。�！

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2樓2015-05-20 20:16:35

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3樓2015-05-21 09:51:05

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請各位前輩給與指導(dǎo)，小妹在此拜謝

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4樓2015-05-21 15:58:31

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5樓2015-05-21 17:36:15

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tency

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308047410: 金幣+5 2015-05-21 21:48:19

1，先根據(jù)你比對的氨基酸位置確定引物上下游，根據(jù)一個(gè)氨基酸密碼子對應(yīng)3個(gè)堿基的關(guān)系，就可以確定上下游引物的距離。2，設(shè)計(jì)好的引物可以再oligo里評價(jià)一下，3，如果是幾個(gè)蛋白質(zhì)比對之后設(shè)引物的話，應(yīng)該就是找保守區(qū)設(shè)引物，如果只是單純找一個(gè)蛋白，想擴(kuò)增背后的基因，可以找它的cds設(shè)計(jì)引物，4，引物驗(yàn)證的話，可以做PCR，然后產(chǎn)物割膠測序，看看。5，我也是新手，最近一直摸索，這是我的一些想法，有不對的地方請?jiān)�。�?

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6樓2015-05-21 17:54:00

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引用回帖:

6樓: Originally posted by tency at 2015-05-21 17:54:00
1，先根據(jù)你比對的氨基酸位置確定引物上下游，根據(jù)一個(gè)氨基酸密碼子對應(yīng)3個(gè)堿基的關(guān)系，就可以確定上下游引物的距離。2，設(shè)計(jì)好的引物可以再oligo里評價(jià)一下，3，如果是幾個(gè)蛋白質(zhì)比對之后設(shè)引物的話，應(yīng)該就是找保 ...

謝謝，我想請問primer5以及DNAMAN可以評價(jià)簡并引物嗎？

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7樓2015-05-21 21:48:02

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希望懂的師兄師姐們能在給點(diǎn)指導(dǎo)意見�。�！謝謝

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8樓2015-05-22 20:19:54

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引用回帖:

9樓: Originally posted by stone2239 at 2015-05-23 01:08:48
1.CODEHOP會根據(jù)每個(gè)block區(qū)同時(shí)設(shè)計(jì)上游引物及下游引物，你截圖中Block unknown__A Oligos下方的5‘→3’的序列就是上游引物；再往下Complement of Block unknown__A Oligos下方的3‘→5’的序列就是下游引物。簡并 ...

還想問一下，如果選出來音舞之后要不要在軟件上評個(gè)分什么的？用什么軟件？怎么評？謝謝啦

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10樓2015-05-23 10:20:43

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