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kid冰貓銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
WB非特異性條帶 已有1人參與
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最近做了幾批western blot實(shí)驗(yàn)，每次顯影都出現(xiàn)很多非特異性條帶，而且亮度都和目的條帶差不多，以前在相同的條件下膜都很干凈的，現(xiàn)在完全不知道問題出在哪，請(qǐng)各位大神指教給點(diǎn)建議。這是我顯影的圖片，非特異性的膜是最近做的，最兩邊的是MARK，以前MARK也不會(huì)被顯出來的，另一個(gè)是之前做的。 4.jpg `9QZ5Q[J}KS~KFNO[{EN4SD.png |
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calorimetry
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| WB非特異性帶出現(xiàn)，最可能是脫脂牛奶封閉效果不好，建議使用新的脫脂牛奶，適當(dāng)加長封閉時(shí)間；另外可能是一抗或者二抗清洗效果差，在兩次清洗時(shí)，請(qǐng)?jiān)黾忧逑磿r(shí)間和清洗次數(shù)；還有可能目的蛋白質(zhì)上樣大了，適當(dāng)減少上樣量；還有一抗的專一性可能不夠，或者稀釋程度不夠，換種一抗看看，可能放的時(shí)間久了也會(huì)有問題，尤其是反復(fù)凍融。 |
kid冰貓2樓2015-06-11 17:39:26
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3樓2015-06-15 09:32:22
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【答案】應(yīng)助回帖
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你可以檢測一下一抗的活性，我懷疑是一抗或者二抗的問題，或者封閉的問題。 如果蛋白質(zhì)的抗原免疫簇改變，那么只是結(jié)合的特一性的一抗會(huì)改變，一般不會(huì)引起啊大量的非特異性的識(shí)別。而且因?yàn)镾DS PAGE處理，WB中的蛋白質(zhì)的抗原免疫簇應(yīng)該主要是序列免疫決定簇，而不是空間免疫決定簇。所以如果真的是目的蛋白質(zhì)本身出了問題，很可能是發(fā)生了降解或者外源性的蛋白質(zhì)污染，SDS PAGE不一定都會(huì)把不同的蛋白質(zhì)分離開，檢測是否有外源蛋白質(zhì)污染或者降解，只要測定一下原來成功時(shí)的目的蛋白質(zhì)的紅外和紫外光譜，這樣樣品也不會(huì)有損失。 蛋白質(zhì)上樣量過大也可能出現(xiàn)非特異性帶。 |
4樓2015-06-15 13:23:04
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