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RNA提取，DNA提取，PCR擴增，變性凝膠電泳，高通量測序的具體步驟
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| 求助實驗方法，RNA提取，DNA提取，PCR擴增，變性凝膠電泳，高通量測序的具體步驟，具體到添加試劑，儀器等 |
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Breeze_liang
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2樓2015-06-16 09:26:18
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16S中的"S"是一個沉降系數(shù),亦即反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個指標,值越高,說明分子越大. rDNA 和rRNA中的小寫字母"r"是ribosome(核糖體)的縮寫. rDNA指的是基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對應的DNA序列,也就是編碼16S rRNA的基因. rRNA指的是rDNA的轉錄產(chǎn)物,它是構成核糖體的重要成分,核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成,16S rRNA是其中一個組件. 一般所分析的對象都是16s rDNA,因為DNA提取容易,也比較穩(wěn)定. 來自https://zuoye.baidu.com/question ... 3162adf37e1c88.html |
3樓2015-06-23 10:47:34
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引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段,可結合在核酸鏈上與之互補的區(qū)域,其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點,核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈.體外人工設計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應、測序和探針合成等. 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列,一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補,另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補. 在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中,已知一段目的基因的核苷酸序列,根據(jù)這一序列合成引物,利用PCR擴增技術,目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,引物與單鏈相應互補序列結合,然后在DNA聚合酶作用下進行延伸,如此重復循環(huán),延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結合 |
4樓2015-06-23 11:05:17
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DNA提取方法為用Fast DNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）試劑盒提取樣品中微生物的總DNA，將提取得到的DNA溶解于70 μL無菌TE緩沖液（10 mmol L-1 Tris-HCl，1 mmol L-1 EDTA，pH 8.0），詳細操作步驟參考試劑盒說明書。通過微量紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）測定DNA濃度和純度（OD260 /OD280和OD260 /OD230）。利用TE緩沖液將樣品中總DNA進行10倍梯度稀釋后，進行PCR擴增，通過凝膠電泳分析樣品DNA中可能存在的腐殖質及其對PCR擴增的影響。土壤DNA保存于-20 °C冰箱中待用。 針對從湖泊沉積物、草甸和鹽堿土中提取的DNA，首先利用通用引物（515 F和907 R）擴增其中的微生物16S rRNA基因，隨后純化PCR產(chǎn)物，步驟如下：0. 25 μL的TaKaRa Ex Taq HS（5 U μL-1），5.0 μL的10×Buffer（Mg2+ Plus），4. 0 μL的dNTP 混合物（各2.5 mmol L-1），1.0 μL的20 μmol L-1引物，加入2.0 μL稀釋10倍的DNA模板至50 μL反應體系，每次PCR反應均設置無菌水的陰性對照。PCR擴增條件為：94 °C，5 min；（94 °C，30 s；55 °C， 30 s；72 °C，45 s），33個循環(huán)；72 °C 10 min。獲得擴增產(chǎn)物后，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0試劑盒( TaKaRa) 進行切膠純化，并將其溶于 30 μL DNase-free H2O。進一步通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物純化效果，測定純化后PCR產(chǎn)物的濃度。 DGGE指紋圖譜分析，取3.0 μL的PCR產(chǎn)物，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增特異性。進一步利用NanoDrop定量PCR產(chǎn)物，每個樣品采用約150 ng 的16S rRNA基因PCR產(chǎn)物進行DGGE分析。DGGE聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度范圍為45%-70%。電泳條件為0.5×TAE緩沖液，80V電壓、60 °C電泳16 h。電泳分析通過Bio-Rad D-Code System完成后，利用SYBR染料染色30 min，進行后續(xù)分析。 DGGE變性梯度凝膠利用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)（Quantity One Bio-Rad，USA）在紫外光下拍攝電泳圖片。將DGGE凝膠上肉眼可辨的優(yōu)勢條帶仔細切下并置于0.5 mL離心試管。利用50 μL的無菌水反復沖洗3次，并通過移液器槍頭將其盡量搗碎后加入20 μL無菌水4 °C浸泡過夜。取2.0 μL上清液作為模板，進一步利用引物GC clamp-515F和907 R 進行PCR擴增。PCR擴 增體系和反應條件如前所述。將PCR產(chǎn)物鏈接到Peasy-T3載體（Trans）并轉化到E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇具有Amp + 抗性的白色轉化子。通過M13F和M13R載體引物進行PCR擴增以驗證陽性克隆。每個DGGE條帶選擇2-3個陽性克隆用于測序。在80%的置信水平通過RDP Classifier進行分類，鑒定到門、綱、目、科和屬不同水平。 DGGE電泳圖譜，運用Quantity One軟件，建立泳道，排除背景干擾，建立并校正條帶，最后自動生成定量報告。報告中包括每個條帶的軌跡定量值Trace（Int×mm），由條帶的光密度和峰面積自動計算得到。 根據(jù)Pi = ni /N，計算DGGE相對豐度Pi。其中，ni為每個條帶的軌跡定量值，N為所有條帶的軌跡定量值ni之和。再計算Shannon多樣性指數(shù)。 |
5樓2015-06-24 15:21:00
6樓2015-06-25 11:00:07
7樓2015-06-28 13:26:37
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8樓2015-06-28 20:49:38
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9樓2015-07-21 09:05:35
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