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RNA提取，DNA提取，PCR擴(kuò)增，變性凝膠電泳，高通量測(cè)序的具體步驟
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| 求助實(shí)驗(yàn)方法，RNA提取，DNA提取，PCR擴(kuò)增，變性凝膠電泳，高通量測(cè)序的具體步驟，具體到添加試劑，儀器等 |
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2樓2015-06-16 09:26:18
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16S中的"S"是一個(gè)沉降系數(shù),亦即反映生物大分子在離心場(chǎng)中向下沉降速度的一個(gè)指標(biāo),值越高,說明分子越大. rDNA 和rRNA中的小寫字母"r"是ribosome(核糖體)的縮寫. rDNA指的是基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對(duì)應(yīng)的DNA序列,也就是編碼16S rRNA的基因. rRNA指的是rDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,它是構(gòu)成核糖體的重要成分,核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成,16S rRNA是其中一個(gè)組件. 一般所分析的對(duì)象都是16s rDNA,因?yàn)镈NA提取容易,也比較穩(wěn)定. 來自https://zuoye.baidu.com/question ... 3162adf37e1c88.html |
3樓2015-06-23 10:47:34
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引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段,可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域,其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn),核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈.體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測(cè)序和探針合成等. 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列,一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ),另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ). 在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)中,已知一段目的基因的核苷酸序列,根據(jù)這一序列合成引物,利用PCR擴(kuò)增技術(shù),目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合,然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸,如此重復(fù)循環(huán),延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合 |
4樓2015-06-23 11:05:17
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DNA提取方法為用Fast DNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）試劑盒提取樣品中微生物的總DNA，將提取得到的DNA溶解于70 μL無菌TE緩沖液（10 mmol L-1 Tris-HCl，1 mmol L-1 EDTA，pH 8.0），詳細(xì)操作步驟參考試劑盒說明書。通過微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）測(cè)定DNA濃度和純度（OD260 /OD280和OD260 /OD230）。利用TE緩沖液將樣品中總DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過凝膠電泳分析樣品DNA中可能存在的腐殖質(zhì)及其對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。土壤DNA保存于-20 °C冰箱中待用。 針對(duì)從湖泊沉積物、草甸和鹽堿土中提取的DNA，首先利用通用引物（515 F和907 R）擴(kuò)增其中的微生物16S rRNA基因，隨后純化PCR產(chǎn)物，步驟如下：0. 25 μL的TaKaRa Ex Taq HS（5 U μL-1），5.0 μL的10×Buffer（Mg2+ Plus），4. 0 μL的dNTP 混合物（各2.5 mmol L-1），1.0 μL的20 μmol L-1引物，加入2.0 μL稀釋10倍的DNA模板至50 μL反應(yīng)體系，每次PCR反應(yīng)均設(shè)置無菌水的陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件為：94 °C，5 min；（94 °C，30 s；55 °C， 30 s；72 °C，45 s），33個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0試劑盒( TaKaRa) 進(jìn)行切膠純化，并將其溶于 30 μL DNase-free H2O。進(jìn)一步通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物純化效果，測(cè)定純化后PCR產(chǎn)物的濃度。 DGGE指紋圖譜分析，取3.0 μL的PCR產(chǎn)物，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增特異性。進(jìn)一步利用NanoDrop定量PCR產(chǎn)物，每個(gè)樣品采用約150 ng 的16S rRNA基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。DGGE聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度范圍為45%-70%。電泳條件為0.5×TAE緩沖液，80V電壓、60 °C電泳16 h。電泳分析通過Bio-Rad D-Code System完成后，利用SYBR染料染色30 min，進(jìn)行后續(xù)分析。 DGGE變性梯度凝膠利用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)（Quantity One Bio-Rad，USA）在紫外光下拍攝電泳圖片。將DGGE凝膠上肉眼可辨的優(yōu)勢(shì)條帶仔細(xì)切下并置于0.5 mL離心試管。利用50 μL的無菌水反復(fù)沖洗3次，并通過移液器槍頭將其盡量搗碎后加入20 μL無菌水4 °C浸泡過夜。取2.0 μL上清液作為模板，進(jìn)一步利用引物GC clamp-515F和907 R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò) 增體系和反應(yīng)條件如前所述。將PCR產(chǎn)物鏈接到Peasy-T3載體（Trans）并轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇具有Amp + 抗性的白色轉(zhuǎn)化子。通過M13F和M13R載體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證陽性克隆。每個(gè)DGGE條帶選擇2-3個(gè)陽性克隆用于測(cè)序。在80%的置信水平通過RDP Classifier進(jìn)行分類，鑒定到門、綱、目、科和屬不同水平。 DGGE電泳圖譜，運(yùn)用Quantity One軟件，建立泳道，排除背景干擾，建立并校正條帶，最后自動(dòng)生成定量報(bào)告。報(bào)告中包括每個(gè)條帶的軌跡定量值Trace（Int×mm），由條帶的光密度和峰面積自動(dòng)計(jì)算得到。 根據(jù)Pi = ni /N，計(jì)算DGGE相對(duì)豐度Pi。其中，ni為每個(gè)條帶的軌跡定量值，N為所有條帶的軌跡定量值ni之和。再計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)。 |
5樓2015-06-24 15:21:00
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高通量測(cè)序時(shí),在芯片上的每個(gè)反應(yīng),會(huì)讀出一條序列,是比較短的,叫read,它們是原始數(shù)據(jù)； 有很多reads通過片段重疊,能夠組裝成一個(gè)更大的片段,稱為contig； 多個(gè)contigs通過片段重疊,組成一個(gè)更長(zhǎng)的scaffold； 一個(gè)contig被組成出來之后,鑒定發(fā)現(xiàn)它是編碼蛋白質(zhì)的基因,就叫singleton； 多個(gè)contigs組裝成scaffold之后,鑒定發(fā)現(xiàn)它編碼蛋白質(zhì)的基因,叫unigene |
6樓2015-06-25 11:00:07
7樓2015-06-28 13:26:37
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