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惰惰228銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
構(gòu)建載體 待插入片段本身就是pcr凝膠回收產(chǎn)物 酶切后還需要再凝膠回收用于連接嗎 已有4人參與
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打算構(gòu)建一個(gè)載體，待插入片段本身就是OE-PCR產(chǎn)物，因有非特異擴(kuò)增 進(jìn)行了凝膠回收； 然后載體和片段分別限制性酶切； 載體進(jìn)行純化（酚氯仿抽提）后用于連接， 片段通常需要進(jìn)行凝膠回收后用于連接， 但我這種情況，還需要再次凝膠回收嗎？還是可以和載體一起進(jìn)行純化？ 請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的大俠指導(dǎo)！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
惰惰228(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:49:17
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
惰惰228(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:49:17
| PCR產(chǎn)物膠回收之后酶切，然后再跑膠回收，最后產(chǎn)物濃度會(huì)非常低的，嚴(yán)重影響連接，而且內(nèi)切酶切割DNA也是需要錨定位點(diǎn)的，所以PCR產(chǎn)物直接酶切本身效率就很低，加上如此折騰，最后連接會(huì)有麻煩，建議如下做，雖然麻煩，但是會(huì)一帆風(fēng)順的：將PCR產(chǎn)物連T載體，選測(cè)序正確的菌株抽提質(zhì)粒再雙酶切，酶切片段在電泳時(shí)很明顯，再膠回收做連接。 |
7樓2015-06-19 20:46:20
2樓2015-06-17 10:47:14
惰惰228
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2015-06-18 00:47:43
4樓2015-06-18 12:19:03
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