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PMD-19-t載體連接問題，真心求助 已有18人參與
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| 目的基因500多bp，pcr用的酶是：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，膠回收后連接，怎么都連接不上，求幫助。 |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-23 21:58:38
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轉(zhuǎn)化后可以提質(zhì)粒跑膠檢測大小，那說明LZ的平板上還是長出來假陽性轉(zhuǎn)化子了，平板上能有多少轉(zhuǎn)化子？ T載體和連接酶都是新的還是在冰箱里放了很久的東西？ 1.如果轉(zhuǎn)化子較多的話有必要做個(gè)藍(lán)白斑篩選，篩查一下你的T載體有問題沒有。以平板上深藍(lán)色轉(zhuǎn)化子作為計(jì)算自連率的標(biāo)準(zhǔn)。 2.如果轉(zhuǎn)化子就那么幾個(gè)，感受態(tài)做一個(gè)陽性對(duì)照，排除感受態(tài)的問題后，還是要從基因載體的濃度和比例以及連接條件上入手： 按照pmd18t的推薦體系：10ul體系：0.03pmol載體：0.1—0.3pmol基因+5ul solutionI 按照NEB的體系：20ul體系：0.02pmol載體：0.06pmol基因+10X T4 ligase buffer+1ul ligase 因此，你的基因如果真是70ng/ul的話,2ul就高達(dá)0.42pmol的濃度，基因過多反而會(huì)降低基因與載體的接觸效率，其次我不知道LZ你的2Xbuffer從哪里來的，一般都是10Xbuffer，管子打開一股濃濃的DTT味道才對(duì)，連接buffer那么稀很難保證長期存放的效果。連接效率低的問題多半在此！ 至于連接條件的優(yōu)化，如果遇到很難連接的體系，我一般會(huì)嘗試二次連接，以Takara10ul連接體系為例，按照上述體系16度過夜連接，早上補(bǔ)加連接酶和連接buffer稀釋到20ul，16度8h 或25度4h，下午3管并1管與感受態(tài)混合轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子只多不少。 3. 如果上述篩查不解決問題的話，只能說明基因沒加上A，將PCR產(chǎn)物加入rTaq及buffer 補(bǔ)加10mM dATP 72度30min加A處理！~ |
11樓2015-06-23 21:44:21
yudaoqian88
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