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alexnoname新蟲 (初入文壇)
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[交流]
請(qǐng)教一些關(guān)于蛋白純化的～問(wèn)題 已有3人參與
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最近本人在延續(xù)師姐的菌株做蛋白下游純化，遇到了一些比較奇怪的問(wèn)題，新手沒(méi)什么經(jīng)驗(yàn)，所以想請(qǐng)教一下大家一些問(wèn)題 1我的蛋白超聲后用1.5ml離心管10000rpm離心10min，上清和沉淀都有蛋白是不是就可以確定一定有包含體也有可溶性表達(dá)？有沒(méi)有可能上清中的蛋白是離心不完全呢？ 2蛋白沉淀用8m尿素還是無(wú)法裂解正常么？ 3用蛋白分析軟件看我的蛋白疏水氨基酸指數(shù)挺高，且分布平均，會(huì)不會(huì)影響其親水氨基酸電離導(dǎo)致預(yù)測(cè)軟件對(duì)等電點(diǎn)預(yù)測(cè)與實(shí)際等電點(diǎn)不合？ 4實(shí)驗(yàn)加入SDS 后完全溶解，老板想讓我加入SDS繼續(xù)做純化過(guò)柱子，請(qǐng)問(wèn)SDS是不是很難除去？會(huì)不會(huì)對(duì)離子柱純化效果產(chǎn)生影響？ |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) |
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看完之后的一點(diǎn)個(gè)人意見，僅供參考，不喜勿噴： 1、上清和沉淀中都有蛋白，我個(gè)人覺得可以估一個(gè)量么，就是看看蛋白大部分是在沉淀里還是上清中，一般包涵體表達(dá)的上清中都會(huì)有一些相應(yīng)的蛋白可溶的。10000rpm 10min應(yīng)該是能夠完全離心的了。 2、8M尿素的溶解效果是不如6M鹽酸胍的，因此有的包涵體蛋白是會(huì)用8M尿素溶解不好的，應(yīng)該也是正常的 3、這個(gè)我就不太了解了 4、應(yīng)該還是對(duì)過(guò)離子柱有些影響的，SDS會(huì)和蛋白結(jié)合帶負(fù)電，這樣的話純化效果估計(jì)會(huì)不太好 |
2樓2015-06-24 08:54:08
惡魔的左眼
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1. 上清和沉淀都有目的蛋白是很常見的事啊，很多蛋白都會(huì)產(chǎn)生可溶性蛋白表達(dá)和包涵體，只是量多量少的問(wèn)題。可以跑電泳看看，根據(jù)表達(dá)蛋白的量再確定是否需要做蛋白復(fù)性 2. Urea的溶解不行就用鹽酸胍吧 3. 疏水氨基酸指數(shù)高對(duì)等電點(diǎn)沒(méi)有影響，只會(huì)影響蛋白的可溶性 4. SDS在后期非常難除去，只能在低溫下不斷稀釋，最后在透析使之不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但想完全除去很難 可以的話建議試試疏水柱純化，應(yīng)該會(huì)有比較好的效果 |
3樓2015-06-24 10:56:00
calorimetry
銅蟲 (正式寫手)
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1我的蛋白超聲后用1.5ml離心管10000rpm離心10min，上清和沉淀都有蛋白是不是就可以確定一定有包含體也有可溶性表達(dá)？有沒(méi)有可能上清中的蛋白是離心不完全呢？ 答：不能。包涵體的形成和溶解都是動(dòng)態(tài)的過(guò)程。 2蛋白沉淀用8m尿素還是無(wú)法裂解正常么？ 答：很正常呀，因?yàn)槌恋眍w粒大，變性劑只能夠接觸到顆粒表面的蛋白質(zhì)，可以適當(dāng)把沉淀雜碎些再用變性劑或者表面活性劑。Urea、鹽酸胍、表面活性劑可輪換使用，還可以適當(dāng)加熱。樓主說(shuō)的沉淀因該是包涵體吧。 3用蛋白分析軟件看我的蛋白疏水氨基酸指數(shù)挺高，且分布平均，會(huì)不會(huì)影響其親水氨基酸電離導(dǎo)致預(yù)測(cè)軟件對(duì)等電點(diǎn)預(yù)測(cè)與實(shí)際等電點(diǎn)不合？ 答：任何分析預(yù)測(cè)軟件都有局限性，可以多用幾種生物信息學(xué)軟件加以等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。順便還可以做個(gè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。 4實(shí)驗(yàn)加入SDS 后完全溶解，老板想讓我加入SDS繼續(xù)做純化過(guò)柱子，請(qǐng)問(wèn)SDS是不是很難除去？會(huì)不會(huì)對(duì)離子柱純化效果產(chǎn)生影響？ 答：直接不除去SDS就用離子交換層析柱的效果不好，我們反正從來(lái)沒(méi)有這樣用做過(guò)，因?yàn)闀?huì)屏蔽蛋白質(zhì)的原有電荷，每1克蛋白質(zhì)平均結(jié)合1.4克SDS，雖然過(guò)柱時(shí)SDS也會(huì)掉下來(lái)，但是肯定不會(huì)全部掉下來(lái)。 |
4樓2015-06-24 11:32:15
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