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[交流]
請教一些關(guān)于蛋白純化的～問題 已有3人參與
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最近本人在延續(xù)師姐的菌株做蛋白下游純化，遇到了一些比較奇怪的問題，新手沒什么經(jīng)驗，所以想請教一下大家一些問題 1我的蛋白超聲后用1.5ml離心管10000rpm離心10min，上清和沉淀都有蛋白是不是就可以確定一定有包含體也有可溶性表達？有沒有可能上清中的蛋白是離心不完全呢？ 2蛋白沉淀用8m尿素還是無法裂解正常么？ 3用蛋白分析軟件看我的蛋白疏水氨基酸指數(shù)挺高，且分布平均，會不會影響其親水氨基酸電離導致預測軟件對等電點預測與實際等電點不合？ 4實驗加入SDS 后完全溶解，老板想讓我加入SDS繼續(xù)做純化過柱子，請問SDS是不是很難除去？會不會對離子柱純化效果產(chǎn)生影響？ |
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 蛋白表達純化與檢測 |
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calorimetry
銅蟲 (正式寫手)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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1我的蛋白超聲后用1.5ml離心管10000rpm離心10min，上清和沉淀都有蛋白是不是就可以確定一定有包含體也有可溶性表達？有沒有可能上清中的蛋白是離心不完全呢？ 答：不能。包涵體的形成和溶解都是動態(tài)的過程。 2蛋白沉淀用8m尿素還是無法裂解正常么？ 答：很正常呀，因為沉淀顆粒大，變性劑只能夠接觸到顆粒表面的蛋白質(zhì)，可以適當把沉淀雜碎些再用變性劑或者表面活性劑。Urea、鹽酸胍、表面活性劑可輪換使用，還可以適當加熱。樓主說的沉淀因該是包涵體吧。 3用蛋白分析軟件看我的蛋白疏水氨基酸指數(shù)挺高，且分布平均，會不會影響其親水氨基酸電離導致預測軟件對等電點預測與實際等電點不合？ 答：任何分析預測軟件都有局限性，可以多用幾種生物信息學軟件加以等電點預測。順便還可以做個蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)預測。 4實驗加入SDS 后完全溶解，老板想讓我加入SDS繼續(xù)做純化過柱子，請問SDS是不是很難除去？會不會對離子柱純化效果產(chǎn)生影響？ 答：直接不除去SDS就用離子交換層析柱的效果不好，我們反正從來沒有這樣用做過，因為會屏蔽蛋白質(zhì)的原有電荷，每1克蛋白質(zhì)平均結(jié)合1.4克SDS，雖然過柱時SDS也會掉下來，但是肯定不會全部掉下來。 |
4樓2015-06-24 11:32:15
andypotter
銅蟲 (初入文壇)
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2樓2015-06-24 08:54:08
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3樓2015-06-24 10:56:00
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