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rola234新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
PCR擴(kuò)增沒(méi)有結(jié)果，求教是引物Tm值相差太大，還是模板GC含量太高？ 已有8人參與
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| 這兩天通過(guò)PCR擴(kuò)增一個(gè)基因，基因本身比較長(zhǎng)，大約1800bp左右，這個(gè)基因序列的GC含量為66%，總體上看還算正常，但當(dāng)中有三四個(gè)區(qū)段的GC含量特別特別高，就是出現(xiàn)連續(xù)幾十個(gè)甚至上百個(gè)GC堿基這樣的序列，我設(shè)計(jì)的上游引物Tm之大約50.6℃，下游引物引物帶入了一個(gè)NotI酶切位點(diǎn)，因此Tm值達(dá)到了66.8℃，兩個(gè)引物的Tm值相差得有點(diǎn)大，今天試著做了一次PCR，但沒(méi)有結(jié)果，我將退火溫度從50℃到65℃做了一個(gè)梯度，但P了10管，都沒(méi)有結(jié)果，非特異性擴(kuò)增也幾乎沒(méi)有，只有最下面有一些引物二聚體。我確信我沒(méi)有加錯(cuò)或者漏加?xùn)|西，而且瓊脂糖電泳也沒(méi)有問(wèn)題，就不太清楚到底是什么導(dǎo)致了PCR擴(kuò)增沒(méi)有結(jié)果，考慮來(lái)考慮去，覺(jué)得只有引物和模板的問(wèn)題比較大，但不確定問(wèn)題到底出在哪，求教小木蟲(chóng)上的各位高手了！ |
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rola234
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2樓2015-07-01 21:46:13
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7樓2015-07-02 16:55:51
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謝謝您的應(yīng)助！今天把退火溫度降到了45℃，果然是有條帶了，但瓊脂糖電泳的結(jié)果很奇怪，明明我的目的條帶應(yīng)該在1750bp左右，但卻跑到了2000bp的位置，難道是我的marker不準(zhǔn)？我也是醉了，打算明天再做一次。Tm值確實(shí)相差太大，這也是一個(gè)教訓(xùn)了，我打算將上游引物重新設(shè)計(jì)一下，在5'端引入一些沒(méi)什么用的GC堿基，來(lái)平衡引物的Tm值。Not I 酶切位點(diǎn)我真是沒(méi)辦法，師兄之前就給我留的這個(gè)酶切位點(diǎn)，不用它構(gòu)建就沒(méi)辦法做了。這個(gè)酶也不算太貴吧，NEB的快酶一支也不到300塊，雖然量不多就是了。切割效率我個(gè)人覺(jué)得還是可以的，而且Not I 酶切位點(diǎn)長(zhǎng)達(dá)8個(gè)堿基，特異性也高，我們實(shí)驗(yàn)室用得還挺多的！ |
8樓2015-07-02 17:25:13
易水秋寒
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3樓2015-07-02 09:32:38
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10樓2015-07-05 10:40:13
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