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rola234新蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR擴(kuò)增沒有結(jié)果，求教是引物Tm值相差太大，還是模板GC含量太高？ 已有8人參與
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| 這兩天通過PCR擴(kuò)增一個(gè)基因，基因本身比較長，大約1800bp左右，這個(gè)基因序列的GC含量為66%，總體上看還算正常，但當(dāng)中有三四個(gè)區(qū)段的GC含量特別特別高，就是出現(xiàn)連續(xù)幾十個(gè)甚至上百個(gè)GC堿基這樣的序列，我設(shè)計(jì)的上游引物Tm之大約50.6℃，下游引物引物帶入了一個(gè)NotI酶切位點(diǎn)，因此Tm值達(dá)到了66.8℃，兩個(gè)引物的Tm值相差得有點(diǎn)大，今天試著做了一次PCR，但沒有結(jié)果，我將退火溫度從50℃到65℃做了一個(gè)梯度，但P了10管，都沒有結(jié)果，非特異性擴(kuò)增也幾乎沒有，只有最下面有一些引物二聚體。我確信我沒有加錯(cuò)或者漏加?xùn)|西，而且瓊脂糖電泳也沒有問題，就不太清楚到底是什么導(dǎo)致了PCR擴(kuò)增沒有結(jié)果，考慮來考慮去，覺得只有引物和模板的問題比較大，但不確定問題到底出在哪，求教小木蟲上的各位高手了！ |
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Jianxiao_H
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9樓2015-07-03 12:31:21
rola234
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2樓2015-07-01 21:46:13
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4樓2015-07-02 09:40:29
5樓2015-07-02 10:34:51
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