 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 9136 | 回復(fù): 15 | ||
rola234新蟲(chóng) (小有名氣)
|
[求助]
PCR擴(kuò)增沒(méi)有結(jié)果，求教是引物Tm值相差太大，還是模板GC含量太高？ 已有8人參與
|
|
| 這兩天通過(guò)PCR擴(kuò)增一個(gè)基因，基因本身比較長(zhǎng)，大約1800bp左右，這個(gè)基因序列的GC含量為66%，總體上看還算正常，但當(dāng)中有三四個(gè)區(qū)段的GC含量特別特別高，就是出現(xiàn)連續(xù)幾十個(gè)甚至上百個(gè)GC堿基這樣的序列，我設(shè)計(jì)的上游引物Tm之大約50.6℃，下游引物引物帶入了一個(gè)NotI酶切位點(diǎn)，因此Tm值達(dá)到了66.8℃，兩個(gè)引物的Tm值相差得有點(diǎn)大，今天試著做了一次PCR，但沒(méi)有結(jié)果，我將退火溫度從50℃到65℃做了一個(gè)梯度，但P了10管，都沒(méi)有結(jié)果，非特異性擴(kuò)增也幾乎沒(méi)有，只有最下面有一些引物二聚體。我確信我沒(méi)有加錯(cuò)或者漏加?xùn)|西，而且瓊脂糖電泳也沒(méi)有問(wèn)題，就不太清楚到底是什么導(dǎo)致了PCR擴(kuò)增沒(méi)有結(jié)果，考慮來(lái)考慮去，覺(jué)得只有引物和模板的問(wèn)題比較大，但不確定問(wèn)題到底出在哪，求教小木蟲(chóng)上的各位高手了！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有124人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 引物GC含量高，怎么調(diào)整PCR體系？
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 基因組PCR用于驗(yàn)證RT-PCR引物的實(shí)驗(yàn)思路，請(qǐng)大蝦們把把關(guān)
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 引物3’端有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，一定p不出來(lái)嗎
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線求助
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 高GC模版擴(kuò)增不出條帶，求PCR高手
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 引物退火溫度怎么確定？
已經(jīng)有26人回復(fù)
- PCR引物GC含量過(guò)低時(shí)候，如何調(diào)整PCR體系？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- PCR上下游引物TM值相差一般多少
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求解釋這pcr是啥問(wèn)題，幫同學(xué)問(wèn)的^_^
已經(jīng)有29人回復(fù)
- 1.5kb的 PCR目的序列GC含量高達(dá)67%，引物Tm值達(dá)90℃，怎么P比較好？
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 【求助/交流】求富含GC的片段的PCR條件
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】基因組PCR老P不出目的帶
已經(jīng)有39人回復(fù)
rola234
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2
- 散金: 5
- 帖子: 58
- 在線: 20.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2986195
- 注冊(cè): 2014-02-22
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
2樓2015-07-01 21:46:13
rola234
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2
- 散金: 5
- 帖子: 58
- 在線: 20.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2986195
- 注冊(cè): 2014-02-22
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
4樓2015-07-02 09:40:29
hanyu426980
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 59.9
- 帖子: 30
- 在線: 6.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 3644786
- 注冊(cè): 2015-01-14
5樓2015-07-02 10:34:51
rola234
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2
- 散金: 5
- 帖子: 58
- 在線: 20.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2986195
- 注冊(cè): 2014-02-22
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
6樓2015-07-02 10:46:43
hl752268023
銅蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 95.5
- 紅花: 1
- 帖子: 7
- 在線: 13.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2817592
- 注冊(cè): 2013-11-21
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
7樓2015-07-02 16:55:51
rola234
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2
- 散金: 5
- 帖子: 58
- 在線: 20.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2986195
- 注冊(cè): 2014-02-22
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
|
謝謝您的應(yīng)助！今天把退火溫度降到了45℃，果然是有條帶了，但瓊脂糖電泳的結(jié)果很奇怪，明明我的目的條帶應(yīng)該在1750bp左右，但卻跑到了2000bp的位置，難道是我的marker不準(zhǔn)？我也是醉了，打算明天再做一次。Tm值確實(shí)相差太大，這也是一個(gè)教訓(xùn)了，我打算將上游引物重新設(shè)計(jì)一下，在5'端引入一些沒(méi)什么用的GC堿基，來(lái)平衡引物的Tm值。Not I 酶切位點(diǎn)我真是沒(méi)辦法，師兄之前就給我留的這個(gè)酶切位點(diǎn)，不用它構(gòu)建就沒(méi)辦法做了。這個(gè)酶也不算太貴吧，NEB的快酶一支也不到300塊，雖然量不多就是了。切割效率我個(gè)人覺(jué)得還是可以的，而且Not I 酶切位點(diǎn)長(zhǎng)達(dá)8個(gè)堿基，特異性也高，我們實(shí)驗(yàn)室用得還挺多的！ |
8樓2015-07-02 17:25:13
易水秋寒
銀蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 20 (小學(xué)生)
- 金幣: 509.5
- 帖子: 39
- 在線: 38.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1343375
- 注冊(cè): 2011-07-12
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
3樓2015-07-02 09:32:38
Jianxiao_H
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 13 (小學(xué)生)
- 金幣: 17.8
- 散金: 681
- 紅花: 14
- 帖子: 916
- 在線: 285.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2468943
- 注冊(cè): 2013-05-17
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 微生物學(xué)
9樓2015-07-03 12:31:21
10樓2015-07-05 10:40:13
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 rola234 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿北化085600材料專(zhuān)碩275|有文章專(zhuān)利｜求調(diào)劑 +6 | Micky11223 2026-03-25 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | A child 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 320分，材料與化工專(zhuān)業(yè)，求調(diào)劑 +9 | 一定上岸aaa 2026-03-27 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南大學(xué)化學(xué)0703總分337求調(diào)劑 +5 | niko- 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué) +10 | 妮妮ninicgb 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +4 | 冬十三 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +7 | 嗯嗯嗯嗯2 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程求調(diào)劑 +9 | 多久上課 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 安徽大學(xué)專(zhuān)碩生物與醫(yī)藥專(zhuān)業(yè)(086000)324分，英語(yǔ)已過(guò)四六級(jí)，六級(jí)521，求調(diào)劑 +4 | 美味可樂(lè)雞翅 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
材料學(xué)碩，求調(diào)劑
 6+5
|
糖葫蘆888ll 2026-03-22 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +6 | wasdssaa 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +6 | Ymlll 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿上海交大生物與醫(yī)藥專(zhuān)碩324分，求調(diào)劑 +6 | jiajunX 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求b區(qū)院校調(diào)劑 +4 | 周56 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +7 | 加一一九 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理085500機(jī)械專(zhuān)業(yè)總分300求調(diào)劑 +3 | an10101 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 300分，材料，求調(diào)劑，英一數(shù)二 +5 | 超贊的 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +4 | LHHL66 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 315分，誠(chéng)求調(diào)劑，材料與化工085600 +3 | 13756423260 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-21 | 3/150 |
|