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小葉子92鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助做過miRNA功能分析的大神們，如何對一個未知功能的新的miRNA進行分析？
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額。。剛?cè)腴T的小白，我要做的是昆蟲中的miR-927a，但是查了之后發(fā)現(xiàn)沒有人做過功能研究，在其他物種中也沒有人做過，沒法參考。。像這種miRNA,我該如何著手做呢？ 我現(xiàn)在有一個大致的步驟：1 對這個miRNA進行靶基因預(yù)測， 2 進行qrt-PCR分析miRNA表達量， 3 進行靶基因3‘UTR熒光素酶告基因的檢測 我現(xiàn)在的問題是：我要做的是對miRNA 的功能進行驗證，是否需要進行miRNA mimics或inhibitor的處理？ 如果需要這一步的話是在熒光素酶檢測之前還是之后？但是用模擬物處理的話好像還需要知道作用的靶基因才行，如果需要知道靶基因的功能，是否需要進行GO通路分析? 現(xiàn)在最大的問題就是是否需要進行GO通路分析來確定靶基因，還有就是希望能幫我看看我的步驟是否需要完善. 謝謝大家�。�！ |
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2樓2015-07-07 15:37:56
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雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炇峭ㄟ^將預(yù)測能夠與miRNA結(jié)合的靶基因3’UTR序列插入載體中螢火蟲熒光蛋白（firefly luciferase）的3’UTR。當我們感興趣的miRNA和質(zhì)粒中的插入序列結(jié)合后，miRNA會通過和所插入的序列結(jié)合從而抑制螢火蟲熒光蛋白的翻譯最終造成熒光值的下降。海腎素熒光蛋白（renilla luciferase）是作為內(nèi)參來去除組間的轉(zhuǎn)染效率差異的。其實你也可以理解為：用熒光值來判斷miRNA是否和靶基因結(jié)合。 1、在了解原理后我們來看一下要做一次熒光素酶報告實驗需要哪些東西： 1. 細胞 許多同學(xué)固執(zhí)的一定要選用目的細胞來做實驗，其實我們本來就是要驗證分子間的相互作用，細胞只是一個媒介或載體，選用工具細胞如293T、HEK293等即可。選擇工具細胞的條件總結(jié)如下： 1）好轉(zhuǎn)染、且轉(zhuǎn)染效率較高 2）目的microRNA的表達水平極低或不表達 2. 質(zhì)粒 首先我們需要螢火蟲熒光素酶3’UTR插入目的序列的載體，通常我們管它叫野生型質(zhì)粒。這里要注意哦，不一定要插入靶基因的3’UTR全長。可以只插入包括miRNA結(jié)合位點前后200bp左右的序列。有的基因3’UTR有幾千到上萬bp。 其次我們需要螢火蟲熒光素酶3’UTR插入miRNA結(jié)合位點突變的序列載體，這個短語好長啊，請各位同學(xué)看清里面的定語。通常管它叫突變型質(zhì)粒。這個質(zhì)粒是整個實驗中至關(guān)重要的一部分。你能不能發(fā)現(xiàn)分子間的直接相互作用就靠它了。 當然，我們需要miRNA的過表達載體。這個不用多說了吧，沒有miRNA怎么做實驗?zāi)亍?br /> 最后也不能少了各種對照載體啊，包括螢火蟲熒光素酶空載體，miRNA空載體還有海腎素熒光載體。 |
10樓2016-09-05 18:09:12
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