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提取質(zhì)粒和搖菌時(shí)候的問題。。。。。。。。。。 已有4人參與
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目的基因與表達(dá)載體連接后，挑取單菌落pcr鑒定正確，然后提取質(zhì)粒酶切鑒定，但是菌液過夜培養(yǎng)一直不夠渾濁（3ml接入400ul菌液），提取的質(zhì)粒也不亮，酶切鑒定過一次，單雙酶切結(jié)果一樣，都是一條帶，大小一樣，我又將同管菌液，質(zhì)粒PCR鑒定，目的條帶也正確，不知道到底是什么原因？？？？？？哪位知道，跪求指點(diǎn)！ |
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123q明: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-08-19 13:00:59
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123q明: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-08-19 13:00:59
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單雙酶切只有一條帶，應(yīng)該有兩種可能，一是酶切根本就沒有切斷，可能是酶切的效率不行，建議使用口碑較好的品牌；二是你目的片段的分子量較大，切下來的碎片段很小，所以看不到碎片段的條帶，這要你自己分析一下是那種情況。 這里我還建議，你試試比較一下酶切后的條帶大小和PCR鑒定的條帶大小是不是差不多大，如果差不多大說明應(yīng)該是酶切掉了。 你說的菌液不濃，我不知道你是用的多大的容器，多少體積的培養(yǎng)液搖的，反正有一點(diǎn)你要注意，液體在容器里搖的幅度必須不能太小，太小的話就等于根本沒有要起來；另外要的時(shí)候一般是在37攝氏度，220 RPM的轉(zhuǎn)速下?lián)u，當(dāng)然這個(gè)條件說的是大腸桿菌，其它菌可能有不同的條件吧。 就說這么多，希望對(duì)你有幫助！ |
10樓2015-07-25 09:56:43
董博士
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 就像3樓的建議，可以擴(kuò)大培養(yǎng)試試，以前我也遇到過菌搖不起來，經(jīng)常要16個(gè)小時(shí)才有渾濁，提取質(zhì)粒濃度低，我的原因是因?yàn)槲业穆《举|(zhì)粒太大了，將近1萬bp，所以有人說質(zhì)粒太大，菌就不好搖，后來擴(kuò)大培養(yǎng)，做大提質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度和純度都還挺好的，不知道你的情況是不是和我一樣 |
4樓2015-07-24 15:35:22
firthzhang
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3樓2015-07-24 11:20:56
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9樓2015-07-25 09:45:23
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