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湖南戴鵬輝新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白質(zhì)純化問題 已有9人參與
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各位大神，我做了蛋白質(zhì)的原核表達(dá)實驗，能清晰的看到目的蛋白質(zhì)表達(dá)了（載體是PET-28a,宿主是BL21（DE3）），但是我后面做蛋白質(zhì)純化實驗的時候不能純化到蛋白。我的超聲波破碎細(xì)胞的條件是：400W，5S破碎，5S停止，30分鐘，后面分別SDS-PAGE檢測上清液和沉淀，發(fā)現(xiàn)上清液沒有純化到我的蛋白，蛋白都在沉淀里面了，條帶特別明顯，不知道怎么回事？是不是細(xì)胞沒有破碎完全呢？怎么樣才能解決這個問題？求大神指點，相互交流。謝謝！ IMG_20160108_170606.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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遇到包涵體的情況最先考慮的不是你破碎的哪些條件等，那都是次要的，不足以導(dǎo)致包涵體的形成。你現(xiàn)在有兩條路可以選擇：要不就繼續(xù)純化包涵體，最后復(fù)性得到蛋白。要不就重新的設(shè)計基因合成新的質(zhì)粒，再次表達(dá)然后純化。你要知道包涵體不是你隨隨便便改變一下誘導(dǎo)條件溫度，換換試劑純化就能避免的，你要從基因的源頭開始考慮。根據(jù)密碼子的簡并性，原核系統(tǒng)不喜歡這個密碼子它就不會老老實實的表達(dá)，就會形成包涵體，要不就表達(dá)量低等情況，所以你要密碼子優(yōu)化，mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化等。。。這就要說的多了。（關(guān)于優(yōu)化可以看一下這篇資料：http://www.detaibio.com/gene-expression-optimization.html） 現(xiàn)在的問題是：蛋白是表達(dá)了，但是你純化不出來蛋白？其實這是一個不算完全正確的說法，因為你只是在上清中沒有得到蛋白，但是你沒有純化包涵體啊（包涵體就是你說的沉淀）。也許你還不太了解原核表達(dá)這個系統(tǒng)，重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有原核 表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，酵母、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，在這之中，原核系統(tǒng)被運用的最為廣泛，原因是因為原核表達(dá)操作簡便，花費少，但是缺點就是表達(dá)的蛋白活性無保證，且無法實現(xiàn)糖基化等修飾，最重要的一點是容易形成包涵體，一般的個人實驗遇到包涵體是很頭疼的，因為沒活性又不好純化，又不好復(fù)性，但是包涵體純度又高，所以既然選擇原核表達(dá)，這是不變的，那就想方設(shè)法的提高原核表達(dá)蛋白可溶性，降低包涵體的產(chǎn)生，方法有很多，例如密碼子優(yōu)化（最為重要），降低誘導(dǎo)溫度，優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)等等，具體優(yōu)化方法可見 http://www.detaibio.com/topics/how-to-express-soluble-protein.html 我勸樓主先決定好選擇那條路走，這是第一步，包涵體純化時間短樓主現(xiàn)在可以就開始純化試試，也要考慮到是否能復(fù)性成功，如果對蛋白活性有要求，建議就不要選擇繼續(xù)純化了吧。。 然后一步一步，慢慢的爭取每一步都是對的！基因也不能隨隨便便設(shè)計，最好找一個有經(jīng)驗的人幫忙，慢可以但是一定一步一個準(zhǔn)！不然到了純化那一步又煩惱了 |
20樓2016-01-28 11:39:30
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10樓2016-01-23 02:20:43
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