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jcstone1027鐵桿木蟲 (正式寫手)
木蟲
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[交流]
兩位點的定點突變 已有3人參與
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想突變基因片段上兩個相隔比較遠(yuǎn)的位點，用DPN1法，因為做一個位點擴增出的是帶缺刻的質(zhì)粒，對于另外一個位點無法以此缺刻質(zhì)粒為模板突變第二處位點，想過用磷酸化的引物，讓第一遍形成的缺刻質(zhì)粒閉合成環(huán)，再以此環(huán)狀質(zhì)粒為模板突變第二處位點，大家覺得第一步擴出的缺刻質(zhì)粒閉合成環(huán)可以實現(xiàn)嗎，有誰這樣做過？十分想知道答案，謝謝大家！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2016-11-25 00:29:33
jcstone1027
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我的意思是第一次擴完重組質(zhì)粒后，它形成的是帶缺刻的質(zhì)粒，我不想立即做轉(zhuǎn)化測序，而是想拿擴增完的缺刻質(zhì)粒再擴，把第二處位點也變回來，因為第一遍形成的是缺刻質(zhì)粒，再用這個模板突變另外一處位點，原理上不能實現(xiàn)，也就是說用帶磷酸化的引物擴重組質(zhì)粒，擴增產(chǎn)物能形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒嗎？我是這個意思，謝謝你的回答 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-11-25 12:10:55
jiananx
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請教一下缺刻質(zhì)粒是什么意思呢？我曾經(jīng)是先突變一個位點，跑膠如果條帶清晰，直接消化后，轉(zhuǎn)化再提取，測序篩選突變成功的再進行第二次突變。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2016-11-25 22:51:35
mailmrcai
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這個不太可行吧，沒試過，一般都是第一步克隆好，再克隆第二步，也不麻煩多少。其實我覺得如果這樣也可以，那還不如直接加四條引物pcr，總會有陽性克隆，可能比例會低點 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-11-25 22:55:56
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