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布丁褚仔新蟲 (初入文壇)
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[求助]
連接轉(zhuǎn)化后平板不長菌 已有1人參與
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質(zhì)粒5k，基因1.5k，因為之前做也一直長不出來，就換了種方法，重新提了質(zhì)粒，然后直接用酶切好的質(zhì)粒和pcr的基因連。質(zhì)粒濃度是 17.8 基因濃度是 8 連接體系是 質(zhì)粒 5.5ul 基因 8ul 5×CEⅡBuffer 4ul ExnaseⅡ 2ul ddH2O 0.5ul 按照說明書是37℃半小時連接 對照組只有質(zhì)粒，（加了感受態(tài)）轉(zhuǎn)化時的感受態(tài)是直接買的，轉(zhuǎn)化效果很好，轉(zhuǎn)化是冰上半小時，42℃水浴1分鐘，冰上2分鐘，搖床200轉(zhuǎn)1小時，結(jié)果感受態(tài)和對照組都沒長，這是什么原因呀，多次重復后都沒結(jié)果 【之前的方法是將雙酶切的基因和質(zhì)粒連接，基因濃度估計10，質(zhì)粒30，連接時兩者摩爾，比例是7，連4小時，轉(zhuǎn)化的方法一樣，但是感受態(tài)和對照組都沒長】 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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你的質(zhì)粒濃度為什么這么低，你點個樣看看是否真的有質(zhì)粒，另外你的線性化的載體和目的片段怎么來的，是切膠純化過的嗎，質(zhì)量怎么樣，是否有污染，尤其是鹽離子，再者你的目地片段和載體用諾維贊的質(zhì)粒應(yīng)在100ng也就是6ul左右，目的片段60ng也就是7.5ul的效果才是最好的，對照也沒有轉(zhuǎn)化有問題，極大可能是質(zhì)粒的問題 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-12-16 18:49:21
2樓2016-12-13 22:47:20
sky蒲公英
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2016-12-14 22:30:29
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2016-12-14 22:30:29
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對照組都沒長，應(yīng)該是在轉(zhuǎn)化這一步出問題了。試著熱激時間延長30s,搖床100rpm左右就行，復蘇用的培養(yǎng)基不要加抗生素。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-12-13 23:48:59
sky蒲公英
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4樓2016-12-13 23:49:36
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