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zhiqiang5070木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
膠回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后菌液PCR電泳條帶出現(xiàn)問(wèn)題
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我的cDNA膠回收后條帶約1000kb強(qiáng)，之后連接到T載體上（將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃連接過(guò)夜，膠回收DNA4.5微，T載體 0.5微，SolutionI 5微升），之后轉(zhuǎn)化到天根公司Ｅ.ｃｏｌｉ感受態(tài)細(xì)胞中，接菌，挑菌后搖菌。之后菌液ＰＣＲ（自己的引物和Ｍ１３引物分別跑了都差不多），可是電泳條帶發(fā)生改變，出現(xiàn)了２０００多ｋｂ的條帶。 各位學(xué)長(zhǎng)學(xué)姐，請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事？好像出現(xiàn)了ｃＤＮＡ自己連接起來(lái)的現(xiàn)象。還有如何解決？本人小蟲(chóng)，沒(méi)啥金幣，還望見(jiàn)諒。 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 【分子生物】EPI帖 |
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3樓2011-06-10 14:56:16
zhiqiang5070
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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上面寫(xiě)錯(cuò)了，我的cDNA為1kb多點(diǎn)，不是1000kb，后面2kb多點(diǎn)，嘿嘿。
2樓2011-06-10 14:52:13
天使托
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(EPI+1): epi大神 2011-06-10 15:14:34
zhiqiang5070(金幣+3): 你很厲害啊，可能是沒(méi)連上，剩余的帶應(yīng)該是空載體和非特異性產(chǎn)物 2011-06-13 08:38:28
zhiqiang5070(金幣+3): 你很厲害啊，可能是沒(méi)連上，剩余的帶應(yīng)該是空載體和非特異性產(chǎn)物 2011-06-13 08:38:28
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著實(shí)感覺(jué)很奇怪，應(yīng)該是一條1KB的條帶。。。 考慮沒(méi)有連接上的情況，2kb很有可能是非特異性條帶； 建議： 1:重新進(jìn)行連接，我看你的連接體系中DNA有點(diǎn)太多了，可以是載體的2-3倍（濃度，這個(gè)需要你跑膠定量的）； 2：將你現(xiàn)在疑似含有重組載體的菌劃至平板上，提取質(zhì)粒，先看看能不能提取出來(lái)，能的話再做一個(gè)酶切看看。。。 |
4樓2011-06-10 15:07:59
Arrennew
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5樓2011-06-10 20:56:37
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