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測酶活前處理心得 已有6人參與
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一般一瓶動物細(xì)胞長滿后用胰酶消化，消化完以后用D-Hinks吹打下來，4℃，1000轉(zhuǎn)，6~10min 離心。倒掉上清，再用D-Hinks重新分散，4℃，1000轉(zhuǎn)，6~10min 離心，倒掉上清（如果暫時(shí)不要測酶活的話，直接將離心后的沉淀凍于-80℃，可保存2~3個(gè)月，用時(shí)直接加生理鹽水進(jìn)行后處理即可）。再用生理鹽水重新分散，槍頭打勻，超聲波破碎，一般一瓶動物細(xì)胞加1mL生理鹽水，一般用總工作時(shí)間300S,，開5S，停10S，槽溫度稍設(shè)高點(diǎn)，一般50℃（此溫度與你EP管內(nèi)的溫度無關(guān)，但是溫度探針伸到反應(yīng)體系中的溫度就得設(shè)低些），20%功率。破碎完后4℃，12000轉(zhuǎn)，5min 離心（看底部的沉淀多少，破碎完全的沉淀應(yīng)該是很少的，如果還很多，重新打散后加時(shí)間再破碎）。將上清取出搖勻后檢測蛋白濃度，我用的是考馬斯亮藍(lán)+BSA法。然后蛋白用于即時(shí)檢測，暫時(shí)不用的話立刻凍在-80℃，可保存2~3天，但破碎后的蛋白最好當(dāng)天檢測，不然活性會受到影響。 [ Last edited by silicare on 2014-5-14 at 18:30 ] |
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7樓2014-05-13 21:34:37
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