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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 細胞科學 » 測酶活前處理心得
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一般一瓶動物細胞長滿后用胰酶消化，消化完以后用D-Hinks吹打下來，4℃，1000轉，6~10min 離心。倒掉上清，再用D-Hinks重新分散，4℃，1000轉，6~10min 離心，倒掉上清（如果暫時不要測酶活的話，直接將離心后的沉淀凍于-80℃，可保存2~3個月，用時直接加生理鹽水進行后處理即可）。再用生理鹽水重新分散，槍頭打勻，超聲波破碎，一般一瓶動物細胞加1mL生理鹽水，一般用總工作時間300S,，開5S，停10S，槽溫度稍設高點，一般50℃（此溫度與你EP管內的溫度無關，但是溫度探針伸到反應體系中的溫度就得設低些），20%功率。破碎完后4℃，12000轉，5min 離心（看底部的沉淀多少，破碎完全的沉淀應該是很少的，如果還很多，重新打散后加時間再破碎）。將上清取出搖勻后檢測蛋白濃度，我用的是考馬斯亮藍+BSA法。然后蛋白用于即時檢測，暫時不用的話立刻凍在-80℃，可保存2~3天，但破碎后的蛋白最好當天檢測，不然活性會受到影響。 [ Last edited by silicare on 2014-5-14 at 18:30 ] |
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