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lx19880717金蟲 (初入文壇)
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[求助]
pET-28a原核不能表達(dá)目的蛋白 已有2人參與
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我在做原核表達(dá)的過程中，使用了pET-28a載體，Rosetta（DE3）表達(dá)菌株，但是37℃誘導(dǎo)表達(dá)后，連包涵體都沒有看到，基本沒有任何的蛋白表達(dá)，所以想請問一下大家，能不能幫我分析一下是什么原因？謝謝。 PS：我的目的蛋白大量重復(fù)序列，是否是由于重復(fù)序列導(dǎo)致蛋白在表達(dá)過程中無法折疊，如果是這個原因有什么辦法可以解決，謝謝。 |
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zhiqiang5070
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+2): 鼓勵交流 2012-03-14 22:15:48
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我跟你一樣，也是用的PET28a，不過我用的菌是BL21。 1.你先到上游看看，是不是載體構(gòu)建的問題；菌p，提質(zhì)粒酶切，測序看看。 2.上游沒問題的話，改變誘導(dǎo)條件試試，T7lac啟動子用IPTG1mM誘導(dǎo)6小時看看； 3你的菌有沒有問題，可以把構(gòu)建的重組載體提出來轉(zhuǎn)化到新的感受態(tài)試試，我的問題就是這么解決滴  4.換高濃度膠跑跑看看，高濃度提高分辨率。 |
4樓2012-03-14 17:49:04
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lx19880717
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【答案】應(yīng)助回帖
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http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html 在線直接就可以分析 如果是稀有密碼子的問題 若不是特別嚴(yán)重可以通過選擇合適的宿主菌解決的。再有就是你關(guān)注一下你的酶切位點，是否導(dǎo)致你的目的片段的讀碼框是否發(fā)生移位。你也可以考慮你的誘導(dǎo)劑加入的濃度，但是一般的情況下不會是主要的原因。 |
8樓2012-04-06 15:12:09
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