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同時(shí)表達(dá)兩種蛋白表達(dá)問(wèn)題
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| 各位蟲(chóng)友，本人最近在做蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，是將兩個(gè)目的蛋白基因通過(guò)RBS相連接的方式克隆到pET30a表達(dá)載體上，用的是較強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子，可是跑SDS-PAGE顯示只表達(dá)了一種蛋白，其中RBS后面的蛋白沒(méi)有表達(dá)，測(cè)序也都是正確！不知問(wèn)題出在哪了？各位有做這種同時(shí)表達(dá)兩種蛋白的嗎？你們是通過(guò)什么方式同時(shí)表達(dá)兩種蛋白？謝謝…… |
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lxj341401
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+3, 鼓勵(lì)發(fā)帖提供有幫助的信息！ 2012-04-07 19:03:18
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共表達(dá)一般采用兩種方式，一種是直接選用共表達(dá)載體，然后把兩個(gè)蛋白基因克隆進(jìn)去；另外一種就是你說(shuō)的方法，把兩個(gè)蛋白基因融合，共用啟動(dòng)子和終止子，在第一個(gè)蛋白終止密碼子和第二個(gè)蛋白起始密碼子中間加上RBS序列。 你的情況也沒(méi)說(shuō)清楚，比如用的什么酶切位點(diǎn)，RBS和第二個(gè)起始密碼子的距離等，無(wú)法幫你分析為什么不表達(dá)。 |
2樓2012-04-07 13:41:41
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我簡(jiǎn)單的介紹一下采用的兩種方法同時(shí)表達(dá)兩種蛋白，用的是pET30a表達(dá)載體。方法一：T7啟動(dòng)子+蛋白A的起始密碼子，蛋白A的序列，蛋白的終止密碼子+RBS+蛋白B的起始密碼子，蛋白B的序列，蛋白B的終止密碼子。其中RBS和蛋白B的起始密碼子直接相連沒(méi)有其余序列。 這個(gè)方法只表達(dá)了RBS序列前的蛋白A，蛋白B沒(méi)有表達(dá)。 方法二：T7啟動(dòng)子+蛋白B的起始密碼子，蛋白B的序列，蛋白A的序列，蛋白A的終止密碼子。利用這種方法是表達(dá)了這種融合蛋白，但是測(cè)酶活發(fā)現(xiàn)活性很低。我表達(dá)蛋白最終是要測(cè)酶活的，酶活性太低是在說(shuō)不過(guò)去。我想是不是這兩種蛋白這樣整合在一起，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，如酶的活性中心發(fā)生改變�，F(xiàn)在我就比較傾向于方法一，只是還搞不明白蛋白B沒(méi)有表達(dá)。不知這樣算說(shuō)明白了嗎？謝謝 |
3樓2012-04-07 15:40:05
lxj341401
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【答案】應(yīng)助回帖
amisking: 回帖置頂 2012-04-07 19:03:27
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你的方案一有點(diǎn)問(wèn)題，RBS和蛋白B的起始密碼子直接相連沒(méi)有其余序列，蛋白B沒(méi)有表達(dá)也正常。SD與起始密碼子間的這一距離影響翻譯起始的效率，最佳的距離約為5-13bp，你從不同的載體圖譜上也可以看到這個(gè)結(jié)論，SD與起始密碼子不是緊挨一起的，中間有序列間隔，你去找本分子生物學(xué)書(shū)仔細(xì)看看這部分內(nèi)容，或者看文獻(xiàn)“在大腸桿菌中高效表達(dá)外源蛋白的策略”。 |
4樓2012-04-07 16:13:08
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